热补针法对寒证类风湿关节炎模型家兔滑膜组织代谢物的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin -

1 1 2 1 1 1 1 1

杜小正 ,袁博 ,王金海 ,方晓丽 ,张星华 ,田亮 ,张婷卓 ,李兴兰 ,曾华宗

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.兰州大学第二医院,甘肃 兰州 730030;

3.上海聚类生物科技有限公司,上海 200433

摘要:目的 通过测定寒证类风湿关节炎( RA)模型家兔滑膜组织内源性代谢物,探讨热补针法治疗RA的特异性机制。方法 采用卵蛋白诱导联合低温冷冻法复制寒证RA 模型。将 40只清洁级青紫蓝家兔随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组,每组8只。除正常组和模型组外,其余各组分别

施以平补平泻、捻转补法、热补针法针刺“足三里”,1次/d,留针 30 min,连续 7d。干预结束后分离家兔膝关节滑膜组织,应用气相色谱-四级杆飞行时间质谱采集各组滑膜代谢物谱图,利用主成分分析和偏最小二乘判别分析对数据进行统计。结果 与正常组比较,模型组家兔滑膜组织代谢物变化主要体现于三羧酸循环、糖类及脂肪酸代谢相关物质增高( P< 0.05);与模型组比较,各针刺组家兔滑膜组织代谢物变化主要体现于上述各种代谢相关物质降低( P< 0.05),且热补针法组三羧酸循环与糖代谢相关物质明显低于平补平泻组和捻转补法组( P< 0.05)。结论 热补针法治疗RA的特异性体现在对三羧酸循环及糖代谢通路的调控。

关键词:热补针法;类风湿关节炎;滑膜组织;代谢组学;气相色谱-质谱法;兔

DOI: 10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.015

中图分类号: R245 文献标识码: A 文章编号: 1005-5304(2017)02-0055-05

Effects of Heat-reinforcing Needling on Synovial Tissues of Rheumatoid Arthritis Rabbits with Cold Syndrome

DU Xiao-zheng1, YUAN Bo1, WANG Jin-hai2, FANG Xiao-li1, ZHANG Xing-hua1, TIAN Liang1, ZHANG Ting-zhuo1, LI Xing-lan1, ZENG Hua-zong3 (1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. The Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, China; 3. Shanghai Biocluster Biotech Co, Ltd., Shanghai 200433, China)

Abstract: Objective To measure the endogenous metabolites in synovial tissues of rheumatoid arthritis (RA) rabbits with cold syndrome; To investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods A total of forty healthy purple blue rabbits were randomly allocated to normal group, model group, reinforcing-reducing needling group (RRN), twirling-reinforcing needling group (TRN) and heat-reinforcing needling group (HRN) 8 rabbits in each group. Arthritis rabbits cold model was made with ovalbumin and freezing. Except for normal groupand model group, RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli (ST36), TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli (ST36), HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli (ST36), once a day and retaining 30 min, a total of seven days. Fresh synovial tissues of rabbits knee joints were extracted after the intervention, then GC-Q/TOF-MS technology were employed to evaluate metabolic profiles. Results The synovial tissues metabolites of TCA cycle, carbohydrate and fatty acid metabolism in model group mainly increased compared with normal group ( P< 0.05); The synovial tissues metabolites of various kinds above-mentioned decreased compared with model group in all intervention of acupuncture group ( P< 0.05), and the metabolites of TCA cycle and carbohydrate metabolism in HRN were obviously less than that of RRN and TRN ( P< 0.05). Conclusion The specificity of heat-reinforcing needling for RA manifests in regulation of TCA cycle and carbohydrate metabolism.

Key words: heat-reinforcing needling; rheumatoid arthritis; synovial tissue; metabolomics; GC-MS; rabbits

基金项目:

国家自然科学基金(81260558);国家中医药管理局甘肃郑氏针法学术流派传承工作室项目(2305135901);甘肃省

自然科学基金(1208RJZA185);兰州市科技计划项目(2014-10247)

类风湿关节炎( rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为主的慢性自身免疫性疾病,该病病程迁延、反复发作,对患者的生活造成严重影响。针灸疗法具有抗炎、免疫调节等作用[1- 3],对 RA具有确切的

[4-5]

临床疗效 。热补针法是郑魁山教授简化烧山火手法和进火法而形成的一种复式手法,具有补益正气、温阳散寒之功用。课题组前期研究表明,热补针法治疗 RA在镇痛方面具有相对特异性[6- 9],但这些初步研究尚不能体现针灸多靶点、多途径、多层次、类似于网络结构的作用特点,缺乏对针刺后机体产生的全部生物信息的综合分析。

代谢组学是一门新兴的系统生物学,通过考察生物体系在外因刺激下其代谢路径及代谢产物的变化,从系统生物学角度研究机体发病及治疗机制的新技

[10-11]

术 。该研究手段的优势与针灸作用特点甚相吻合。为了进一步深入研究热补针法治疗RA的特异性机制,课题组前期以寒证RA模型家兔为载体,对家

[12]兔尿液内源性代谢物进行了分析 。本实验进一步观察热补针法干预对家兔模型关节滑膜组织代谢物的影响,从系统生物学角度探讨热补针法治疗RA的特异性机制。

1 材料与方法 1.1 动物

2~3月龄清洁级健康青紫蓝家兔40 只,雌雄各半,体质量( 2.5±0.5)kg,兰州生物制品研究所,动物许可证号 SCXK(甘) 2012-0001。饲养于温度( 20±2)℃,相对湿度( 50±10)%,每日光照时间

12 h,自由进食饮水。

1.2 针具、主要试剂与仪器

针灸针(华成牌,苏州东邦医疗器械有限公司)。卵蛋白干粉(批号 A5253-250G)、弗氏完全佐剂(批号 F5881),Sigma 公司。甲醇、吡啶,国药集团;尿素酶、甲氧胺盐酸吡, Sigma 公司。Agilent GC/MS系统、毛细管色谱柱, J&W Scientific 公司。

1.3 分组及造模

家兔适应性饲养7 d,随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组,每组8 只。采用卵蛋白诱导联合低温冷冻进行 RA 寒证模型复

[13-14]

制 。实验正式开始前 3 d,剃去家兔背部肩胛骨间的毛。将4 mg/mL卵蛋白溶液与等量弗氏完全佐剂混匀,充分震荡成乳化剂, 2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均匀选定的6个点,每点皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同剂量重复皮下注射1次。第2 次免疫后6 d,剃去家兔双后腿膝关节周围的毛, 2%碘 酒、75%乙醇消毒双膝关节,关节内注入 20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液0.4 mL。24 h内膝关节出现红肿触痛,表明模型复制成功。成模后第2日,乙醇消毒两后腿足,上、下、左、右围置冰袋,温度降至-20~ -25 ℃冷冻 1.5 h,45 ℃温水复温5 min。冷冻后 14 d,家兔表现为精神萎靡不振,两后肢匍伏跛行,膝关节肿胀、周径明显大于正常组,局部青紫、皮温不高,表示成功建立RA寒证模型。

1.4 针刺方法

[15]先将家兔固定,选取后腿“足三里” 。各针刺组分别施以相应针法。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》[ 16]:左手拇指紧按穴位,右手持针刺入穴内8~

12 mm,针刺得气后,左手加重压力,右手拇指向前连续捻按5次;针下沉紧后针尖拉着有感应的部位,连续重插轻提5次;拇指再向前连续捻按5次,反复操作 1 min;最后使针下沉紧,留针30 min。平补平

[17]泻法、捻转补法操作参照《刺法灸法学》 。平补平泻法:针刺得气后,前后均匀捻转,不单向捻转,指力均匀,角度 180~360 º,频率 60~90 r/min,反复操作 1 min。捻转补法:针刺得气后,小幅度前后捻转针体(角度 180~360 º,频率 60~90 r/min),拇指向前左转时用力重、指力沉重向下,拇指向后右转还原时用力轻,反复操作1 min。每日1次,每次留针

30 min,连续 7d。

1.5 样本采集

针刺干预结束后,耳后缘静脉注射空气处死家兔,分离各组家兔双侧膝关节滑膜组织,于冻存管内置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 样品衍生化处理

室温解冻后,取100 μL 样本于 1.5 mL EP管中,采用甲醇沉淀蛋白,其比例为样品∶甲醇= 1∶4,涡旋 30 s,4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min,吸取 200 μL上清液,转入进样小瓶中待测。将进样小瓶置于温和氮气下吹干,加入30 μL甲氧胺吡啶( 20 mg/mL)溶液,剧烈震荡30 s,37 ℃肟化反应90 min,取出后加 30 μL BSTFA(含 1%TMCS)进行衍生, 70 ℃反应 60 min,室温静置 30 min 备检。

1.7 气相色谱-质谱条件

进样口温度 280 ℃, EI 离子源温度 230 ℃,四极杆温度 150 ℃,高纯氦气(纯度> 99.999%)作为载气,不分流进样,进样量1.0 μL。升温程序为:初始温度 80 ℃,维持 2 min, 10 ℃/ min 速度升至320 ℃,维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测,质谱检测范围为 50~550 m/z。采用随机顺序进行连

续样本分析,避免仪器信号波动所造成的影响。

1.8 统计学方法

在R软件平台下采用XCMS软件对GC/MS S数据进行预处理,并在 Exceel2010 软件中进行后期编辑,将最终结果组织为二维数据矩阵,包括变量(保留时间、质荷比)、观察量(样本)和峰强。然后将所有数据归一化到总信号积分。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P13 3.0 进行主成分分析( PC CA)、偏最小二乘法判别分析( PLS-DA), ,最后获得差异物质。P<< 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 原始色谱图的可视化检查

每组样本的离子流色谱图( TI C)见图 1。仪器的保留时间重现性良好,仪器稳定,因而提高了仪器分析和数据结果的可靠性。

2.2 模式识别

各组P CA图见图2。图 2显示,各组家兔滑膜组织代谢物分布区域可以相互区分,且各治疗组代谢物均向正常组回归,热补针法组较其他治疗组尤为明显。为了对数据进一步分析,采用监督性 PLS-DA,见图 3。根据PLS-DA 模型的 VIP 值(阈值> 1),1并结合 t 检验的P 值( P<< 0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为:在线搜索Me etlin 数 据库( https://metlin.m scripp ps.edu/index.php)p比较质谱的质荷比。结果见表1。

Newspapers in Chinese (Simplified)

Newspapers from China

© PressReader. All rights reserved.