桦木酸对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin -

1,2 2 2 2 2 2陈飞宇 ,李澎 ,甘加宽 ,张安娜 ,任钧国 ,刘建勋

1.北京中医药大学研究生院,北京 100029;

2.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所,中药药理北京市重点实验室,北京 100091摘要:目的 观察桦木酸( betulinic acid,BA)对人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞增殖的影响,并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。方法 体外培养人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞并证明其自我更新能力。CCK-8 法检测 40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA作用人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞24、48 h 的细胞活力; 40、20、10、5 μmol/L BA作用人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞48 h,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果 BA对人肝癌 HepG2肿瘤干细胞增殖有明显的抑制作用,并呈一定的量-效关系; BA能明显影响肿瘤干细胞周期,诱导肿瘤干细胞凋亡, 40 μmol/L BA明显阻滞细胞周期于S期,且细胞凋亡率达到 10.86%。结论 BA 对人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞增殖具有明显的抑制作用,其可能通过影响肿瘤干细胞周期及诱导肿瘤干细胞凋亡而发挥作用。

关键词:桦木酸;石见穿;人肝癌HepG2细胞;肿瘤干细胞;细胞凋亡

DOI: 10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016中图分类号: R285.5 文献标识码: A 文章编号: 1005-5304(2017)02-0060-05

Effects of Betulinic Acid on Proliferation of Human Liver Cancer HepG2 Cells CHEN Fei-yu1,2, LI Peng2, GAN Jia-kuan2, ZHANG An-na2, REN Jun-guo2, LIU Jian-Xun2 (1. Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2. Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica, Beijing 100091, China)

Abstract: Objective To observe the effects of betulinic acid (BA) on proliferation of human hepatoma stem cell; To discuss its anti-cancer mechanism from the aspects of cell cycle and cell apoptosis. Methods HepG2 stem cells were cultivated in vitro and testified the self-renewal capacity. The effects of BA in concentration of 40, 20, 10, 5, 2.5,

1.25 μmol/L on the cell vitality of cultured human liver cancer stem cells for 24 and 48 hours were measured with

CCK-8 method. The human hepatoma stem cell line HepG2 was administrated by BA at concentrations of 40, 20, 10,

5 μmol/L for 48 hours, and cell cycle and apoptosis rate were measured by flow cytometry. Results BA could inhibit

HepG2 stem cell proliferation obviously with dose-effect relationship. BA influenced cell cycle, and induced tumor stem cell apoptosis. 40 μmol/L BA blocked cell cycle in S phase, and cell apoptosis rate reached 10.86%. Conclusion BA has obvious inhibitory effects on proliferation of HepG2 liver cancer stem cell, which probably plays a part in anti-cancer by influencing cell cycle and inducing cell apoptosis.

Key words: betulinic acid; Salvia chinensis; human hepatoma cells; cancer stem cell; cell apoptosis

肝细胞癌( hepatocellular carcinoma,HCC)是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示,肝癌在 60 岁以下的男性

[1]中属发病率最高和死亡率最高的癌症 。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性,治疗效果并不乐观。近年来,越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗 基金项目:中国中医科学院自主选题项目(ZZ0708099)通讯作者:任钧国,E-mail:reek2003@163.com 法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞,更重要的是

[2-3]靶向其中的肿瘤干细胞 。肿瘤干细胞( cancer stem cell,CSC)是肿瘤组织中存在的极小部分细胞,通常处于静止状态,当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发,这均源于 CSC 拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以 S180 荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选,发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4- 5],进一步对石见穿进行化学成分分析,发现桦木酸( betulinic acid,BA)

为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此,本实验观察BA对人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞增殖的影响,并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肝癌 HepG2 细胞株,中国科学院细胞库,目录号 TCHu72。

1.2 主要试剂与仪器

BA(Sigma),5-氟尿嘧啶( 5-FU,海普药业),胎牛血清( Gibco),DMEM/F12+GlutaMAX-I 培养基( Gibco),肝素( Sigma),B27 神经细胞生长添加剂( Gibco),碱性成纤维细胞生长因子( bFGF, Acro Biosystem ),成纤维细胞生长因子( EGF, Acro Biosystem ), BSA ( Sigma ),青链霉素混合液( Solarbio),磷酸盐缓冲液( HyClone),0.25%胰蛋白酶、DMSO( MP Biomedicals),无酚红 DMEM ( Macgene),CCK-8 试剂盒( Dojindo),细胞周期试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司), FITC Annexin V凋亡试剂盒( BD)。MCO175 型 CO2培养箱(德国Galaxy公司), TH-200型显微镜(日本Olympus公司),

Stnergy-4 型酶标仪(美国 Biotek 公司), IEC-CL31R型离心机(美国 Thermo Fisher 公司), NAVISO 型流式细胞仪(美国 Bechman Coulter 公司), JCSO344 型高压蒸汽灭菌锅(日本 Hirayama 公司)。

2 实验方法

2.1 人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞培养

参考文献[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌 HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。

2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、

4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌 HepG2 细胞,胰酶消化无血清培养基重悬,计数,稀释为2×103/mL,

2.5 mL/孔,则 5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于

37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3d半量换液。

2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球(约6 d),进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中, 800 r/min 离心5 min,1 mL胰酶替代物 TrypLE Express 消化,加胰酶时吹打几下稍等片刻,即可加PBS 稀释,离心洗涤 2~3 次后无血清培养基重悬,再取适量加无血清培养基稀释培养。

2.2 分组和给药

正常组: DMEM 培养基;对照组: DMEM 培养基(含 0.01%DMSO);5-FU 组: 10 μg/mL 5-FU;BA各剂量组: DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA,实验过程中以 1000 倍培养液稀释为40 μmol/L,同时等比对倍稀释分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的 BA培养液。

2.3 细胞自我更新能力验证

收集肿瘤干细胞,无血清培养基稀释为每毫升500 个。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL 无血清培养基,并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔加入 96 孔板。镜下观察,选取有且仅有1个细胞的孔每日拍照记录。

2.4 细胞增殖检测

将对数生长期的人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞制成

1×108/L 的细胞悬液,接种于低吸附 96 孔板,于

37 ℃、5%CO2培养箱中培养, 24 h后更换不含细胞因子的 DMEM/F12 培养基同步化使细胞处于G0 期,

24 h后分组处理,分别培养于BA浓度为 40、20、10、

5 μmol/L 的无血清培养基中,每组设5个复孔,继续培养。48 h后弃上清液, PBS 冲洗 1遍后每孔加入配制好的 CCK-8 试剂 120 μL,培养箱中继续孵育2h。将显色完成的液体转移至正常 96 孔板中,于酶标仪波长 490 nm处检测吸光度( OD)值。计算细胞抑制率。细胞抑制率( %)=(对照孔OD值-给药孔OD值)÷对照孔OD 值×100%。

2.5 细胞周期检测

将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化,无血清培养液重悬,计数,稀释为5×103/mL,3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球,将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中, 1500 r/min 离心 5~10 min,吸弃原培养液, PBS 冲洗 1遍,加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心,吸弃无血清培养基,按照分组给药。药物作用48 h后,将各组细胞培养液收集到离心管中。1000×g 离心 3~5 min,沉淀细胞。吸除上清,加入约1 mL冰浴预冷的PBS 重悬细胞,并转移至 1.5 mL 离心管中。再次离心沉淀细胞,弃上清,加入1 mL冰浴预冷的70%乙醇,轻轻吹打均匀, 4 ℃固定,过夜。离心,沉淀细胞,弃上清液,用1 mL冰浴 PBS 冲洗 1遍。每管细胞样品中加入 0.5 mL碘化丙啶染色液,缓慢并充分重悬细胞, 37 ℃避光温浴30 min,24 h内流式细胞仪检测。

2.6 细胞凋亡检测

将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化,

无血清培养液重悬,计数,稀释为5×103/mL,3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球,将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中, 1500 r/min 离心 5~10 min,吸弃原培养液, PBS 冲洗 1遍,加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心,吸弃无血清培养基,按照分组给药。药物作用48 h后,将各组细胞培养液收集到离心管中, 1500 r/min 离心 5~10 min,吸弃上清液,加入1 mL冰浴预冷的PBS冲洗细胞2次。用 1×Binding Buffer 缓冲液制成 1×106/mL 的悬液,吸取上述悬液 100 μL 至 Falcon 试管,加入 FITC Annexin V和碘化丙啶染料,轻轻涡旋,室温避光放置 15 min 后,分别加入 1×Binding Buffer 缓冲液400 μL,1 h内流式细胞仪检测,严格按照凋亡试剂盒说明书进行操作。

3 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,各组数据通过正态性分布检验和方差齐性—检验后,组间比较采用方差分析或者非参数检验法。P< 0.05表示差异有统计学意义。

4 结果 4.1 人肝癌 HepG2肿瘤干细胞自我更新能力

选取有且仅有1个细胞的孔连续观察,第6日可看到细胞增殖,第8日细胞增殖数目明显增多。结果见图 1。

4.2 桦木酸对人肝癌 HepG2肿瘤干细胞增殖的影响

与正常组比较, BA对人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞体外增殖活力具有一定的抑制作用,随BA作用剂量增加和作用时间的延长,其抑制作用相对增强。作用24 h IC50 为 22.61 μmol/L,48 h IC50 为 18.30 μmol/L。结果见表1、表 2、图2。

4.3 桦木酸对人肝癌 HepG2肿瘤干细胞周期的影响

与正常组比较, 5-FU 组 G1/G0 期细胞显著增多、G2/M期细胞显著减少,差异有统计学意义( P< 0.05, P< 0.01),40 μmol/L BA 组 G1/G0 期和 G2/M 期细胞明显减少,差异有统计学意义( P< 0.05, P< 0.01)。结果见表3、图 3。

4.4 桦木酸对人肝癌 HepG2H肿瘤干细胞凋亡的影响

与正常组比较, 5-FUF组和 10、20、40 μmoll/L BA组凋亡率显著升高( P< < 0.05, P< 0.001),见表4、图 4。

5讨论

BA 是一种五环三萜类化合物,最早发现于桦木属植物白桦的树皮中。研究发现, BAA 具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种药理活性[ 8],其中抗肿瘤是该化学成分的主要药理作用。2 20 世纪 90年代,科学家对

25 500种植物提取物进行抗癌活性实验,发现BA对人黑色素瘤具有选择性的抗癌活性[ 9],随后在乳腺癌、脑癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等常见肿瘤中均验

[10]

证了BA的抗肿瘤作用 。与 BA对多种肿瘤具有潜在毒性不同的是,非肿瘤细胞及正常组织对BA有相

[11]

对抵抗性 。

目前关于BA的抗肿瘤作用及机制已进行了许多研究,但有关该化学成分对肝癌的作用研究至今还未见报道。因此,本实验观察对无血清培养的人肝癌

HeepG2 肿瘤干细胞的自我更新能力进行了验证。其次, CCK-8 实验结果显示, BA作用 484 h后,对人肝癌HepG2 肿瘤干细胞增殖活力抑制作用增强,并呈明显的量-效关系。我们前期研究发现, BA 对 HeppG2细胞的 IC50 为19.68 μmol//L,而该实验中BA作用于

HeepG2 干细胞48 h 的 IC50 0为 18.30 μmmol/L,表明BA在抑制 HepG22 干细胞与 HHepG2 细胞的增殖活力上效果相似。我们通过流式细胞仪进行细胞周期检测发现,高浓度BA A(40 μmol/L L)能抑制 HepG2H肿瘤干细胞从S期进入G2/M期,将其阻滞于S期,表明高浓度BA通过抑制DNA的合成抑制HepG G2细胞的生长。而5-FU则是将HepG2干细胞周期阻滞于G0/G1期来抑制细胞增殖,表明BA 与5-FU 对 HepG2H干细胞具有不同的作用途径,其分子机制有待进一步研究。

细胞凋亡是正常的生理过程,此过程中,细胞膜保持完整,胞内物质不释放出胞外,不引发胞外组织

[12] ]

的炎性反应 。有研究表明, BA 通过诱导黑色素瘤

[13]细胞的凋亡发挥其抗肿瘤作用。蒋孟军等 认为, BA能够体外抑制胰腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡。

[14]

Chhakraborty B等 也发现, BA衍生物是人结肠癌细胞HT-29细胞凋亡的诱导剂。同时,本实验也发现, BAA 可明显诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡,且具有明显的浓度依赖性。40 μmol/L BA作用于 HepG2H细胞后,其凋亡率可达10.86%,可见BA的抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡有密切的关系。

细胞凋亡与细胞周期之间有许多潜在的关系,通常细胞先被阻滞于细胞的某一周期,然后诱导其发生凋亡,目前很多肿瘤化疗药物正是通过细胞周期阻滞来诱导细胞凋亡,从而达到治疗肿瘤的目的。蒋孟军

[13]

等研究表明, BA 将胰腺癌细胞阻滞于 G0 期来诱

[15]

导其凋亡。Foo JB 等 发现, BA作为黄花第伦桃二氯甲烷提取物的主要成分,通过 p53/p21 通路将乳腺癌 MCF-7 细胞阻滞于 G0/G1 期。但本实验发现,低浓度 BA(5~20 μmol/L)几乎对细胞周期没有影响,而对 HepG2 细胞的凋亡率作用显著,可见 BA 对

HepG2肿瘤干细胞的凋亡与周期阻断并无特定联系。高浓度处理的细胞被阻滞于S期,说明BA通过S 期阻断而诱导细胞凋亡,这可能是BA诱导 HepG2 肿瘤干细胞凋亡作用途径的一部分,而低浓度BA诱导凋亡的作用方式并未通过细胞周期阻滞实现,这与高浓度 BA诱导凋亡的途径不同。因此, BA 诱导 HepG2干细胞的细胞凋亡可能是多途径的复杂过程, BA 对人肝癌 HepG2 肿瘤干细胞的增殖抑制作用仍有待于进一步研究。

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(收稿日期: 2016-04-20) (修回日期: 2016-05-05;编辑:华强)

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