槲皮素对转化生长因子诱导人脐静脉内皮细胞内皮-间质转化的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin -

1 2 3吴微 ,杨柳 ,徐翊

1.长江航运总医院,湖北 武汉 430010;2.武汉大学医院,湖北 武汉 430071;3.武汉市第六医院,湖北 武汉 430015

摘要:目的 观察槲皮素对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人脐静脉内皮细胞( HUVEC)-12 内皮-间质转化的影响,探讨其作用机制。方法 CCK-8法检测不同浓度槲皮素和/或 TGF-β1 干预 HUVEC-12 72 h后细胞活力; RT-PCR和免疫荧光双染检测内皮及间质标记物的转变; Western blot 检测信号通路; RT-PCR 检测在转变过程中发挥关键调节作用的转录因子。结果 RT-PCR和免疫荧光双染结果均提示, TGF-β1(10 ng/mL)连续刺激 HUVEC-12 72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型,表现出更多的间质标记物升高,内皮标记物降低; Western blot 和 RT-PCR结果显示,槲皮素呈浓度依赖性抑制smad2/3 的磷酸化; TGF-β1 刺激后,下游调控内皮-间质转化的重要转录因子 snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2 均明显升高,而 100 μmol/L 槲皮素则可显著下调下游的5种转录因子。结论 槲皮素可抑制 TGF-β1 诱导的 HUVEC-12 发生内皮-间质转化而发挥抗纤维化的作用。

关键词:槲皮素;内皮-间质转化;脐静脉内皮细胞;纤维化

DOI: 10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017中图分类号: R285.5 文献标识码: A 文章编号: 1005-5304(2017)02-0065-05 Effects of Quercetin on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Undergoing Endothelial

to-mesenchymal Transition Induced by TGF-β1 WU Wei1, YANG Liu2, XU Yi3 (1. General Hospital of the Yangtze River Shipping, Wuhan 430010, China; 2. The Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China; 3. Sixth Hospital of Wuhan, Wuhan 430015, China)

Abstract: Objective To investigate the effectsof quercetin on human umbilical vein endothelial cell

(HUVEC)-12 undergoing endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) induced by TGF-β1; To discuss its mechanism of action. Methods Cell activity of intervening by quercetin with different concentrations and TGF-β1 for

72 h was detected by CCK-8 method; RT-PCR and immunofluorescence staining were used to detect the transition of endothelial and stromal markers; Western blot was used to detect the signal transduction pathway; RT-PCR was performed to detect the transcription factors that play crucial roles in the process of transformation. Results The results of RT-PCR and immunofluorescence double staining showed that TGF-β1 (10 ng/mL) stimulated HUVEC-12 cells for 72 h to induce fibroblast phenotype, showing more interstitial markers and less endothelial markers; Western blot and RT-PCR results showed that quercetin inhibited the phosphorylation of smad2/3 in a concentration-dependent manner; After TGF-β1 stimulation, the downstream transcription factors EndMT of snail1, twist1, twist2, ZEB1, and

ZEB2 significantly increased, while 100 μmol/L quercetin could down-regulate the five downstream transcription factors. Conclusion Quercetin has anti-fibrosis effects through inhibiting HUVEC-12 cells undergoing EndMT.

Key words: quercetin; endothelial-to-mesenchymal transition; umbilical vein endothelial cell; fibrosis

心室重构过程中会发生心肌间质纤维化,而间质纤维化的主要特点为细胞外基质过度沉积和间质细胞如肌成纤维细胞的增殖,进而导致心肌组织毛细血管密度降低,心室顺应性也降低,最终心肌顺应性下降,导致心力衰竭。研究显示,抗纤维化治疗可明显改善心力衰竭患者预后,在心肌纤维化进程中,除固 有的成纤维细胞会发生活化增殖外,内皮细胞、上皮细胞、单核细胞、循环纤维细胞等均可通过一定机制转化为成纤维细胞,抑制内皮-间质转化可显著改善

[1-2]

心室重构及心功能 。

槲皮素及其衍生物分布广泛,现代药理研究表明,其具有抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集、保护心

血管功能以及抗病毒的作用[ 3],具有抑制成纤维细胞增殖、抑制胶原合成、阻止氧化损伤、抑制血管生成

[4-5]

等抗纤维化作用 。本实验观察槲皮素对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)-12 内皮-间质转化的影响,探讨其作用机制。

1 实验材料 1.1 药物

槲皮素,购自上海融禾医药科技发展有限公司,纯度≥ 99%,货号 117-39-5。

1.2 细胞

HUVEC-12,YRGene(NC006)。37 ℃、5.0%CO2培养箱培养,当细胞密度铺满80%培养皿底时,采用

0.25%胰酶消化后进行传代。对细胞采取刺激前,将培养细胞所用的培养基换为无血清培养基。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM basic( 1×)培养基、新生小牛血清( NBS)、胰酶, Gibco; CCK-8 检测试剂盒,日本同仁化学研究所; RT-PCR 试剂盒, Roche;TGF-β1, PEPROTECH 公司; ECGS,ScienCell 公司; CD31、vimentin 抗体, ABCAM 公司; p-smad2、p-smad3、GAPDH,Cell Signaling Technology 公司; smad2、

smad3,Santa Curz公司;引物由上海生工合成。多功能微孔板检测系统 Synergy HT(美国 BioTek),恒温培养箱(日本SANYO),紫外分光光度计NANODROP

2000c(Thermo scientific),RT 反转录仪 Veriti 96 well Thermal Lycler(Applied Biosystems),实时定量PCR仪 Light Lycler 480(美国 Roche),倒置相差显微镜

DP72(日本 OLYMPUS)。

2 实验方法

2.1 细胞处理及分组

待HUVEC细胞生长密度达60%时,弃去培养基, PBS 清洗 3次,加入无血清培养基, 4h后置换为含

TGF-β1(10 ng/mL)无血清培养基,置于温箱培养,

12 h 换液1次, 72 h后收取蛋白质和RNA样本。实验分为对照组、TGF-β1 组、TGF-β1+槲皮素10 μmol/L组、TGF-β1+槲皮素 50 μmol/L 组、TGF-β1+槲皮素

100 μmol/L 组、槲皮素 100 μmol/L 组。

2.2 细胞毒性试验

细胞被接种至96孔板中,每孔 100 μL,密度为2×105个/mL,置于温箱培养 24 h,将培养基更换为无血清培养基饥饿6 h,干预 72 h,将 96 孔板中培养基换为含有 10 μL CCK-8 无血清培养基 100 μL,继续孵育 2~2.5 h,于酶标仪波长 450 nm处测定光 密度( OD)值。2.3 RT-PCR 检测

细胞以不同因素处理后,弃去培养基, Trizol 法提取细胞总 RNA,紫外分光光度法测定其含量与纯度。取大约5 μL 总 RNA反转录为 cDNA。以 GAPDH为内参,应用20 μL体系进行PCR扩增。反应条件:

94 ℃、2 min,1 个循环; 94 ℃、40 s,25~35 个循环; 50~65 ℃、40 s,72 ℃、1 min,72℃、5 min,

1个循环。

2.4 Western blot 检测

细胞裂解液冰上裂解细胞10 min,手机并提取蛋白。校正 GAPDH 后,每组以校正后体积进行10%SDS-PAGE 凝胶电泳,后将蛋白以100 V、90 min转移至 PVDF 膜上,用一抗封闭液( 1∶1000)进行封闭,然后用 TBST洗膜,一抗孵育过夜后加入相对应的二抗( 1∶5000)行显色反应。应用 Odyssey 图像分析软件检测各组蛋白的相对密度值作为蛋白表达水平,均以GAPDH 作为内参。

2.5 免疫荧光双染检测

干预结束后,弃去培养基, PBS 漂洗 3 次, 4%多聚甲醛固定10 min,PBS 漂洗3次,再以 0.2%Triton通透细胞5 min,PBS 漂洗 3次,细胞爬片滴加25 μL 8%新生胎牛血清,置于湿盒内,置于37 ℃温箱中孵育 1 h,滤纸将封闭液吸干,滴加含有 CD31/vimentin的一抗稀液( 1∶200),置于 4 ℃冰箱过夜,将湿盒取出置于 37 ℃温箱复温1 h,将细胞爬片从24 孔中取出,置于防脱切片上,滴加含有2种不同颜色的二抗( 1∶2000),室温下避光孵育1 h,PBS 漂洗 3次, DAPI封片置于正置荧光显微镜下观察并拍照。

3 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,多组间均数比较采用方差分析,组间两两—

均数比较采用 S-N-K 法(方差齐)或 Dunnett's T3(方差不齐)检验。P< 0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 槲皮素对人脐静脉内皮细胞-12细胞活力的影响

干预 72 h 后, 10、50、100 μmol/L 槲皮素及其与

TGF-β1 的混合液对 HUVEC-12 细胞活力与未加任何处理因素的对照组比较,差异均无统计学意义( P>

0.05)。结果见表1。

4.2 槲皮素对转化生长因子-β1 诱导的人脐静脉内

皮细胞-12发生内皮-间质转化的影响

槲皮素( 10、50、100 μmol/L)与 TGF-β1 协同刺激 HUVEC-12 72 h呈浓度依赖性抑制Ⅰ型胶原蛋

白( Collageen Ⅰ)、α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA A)、波形蛋白( viimentin)、纤维连接蛋白( fibronecti in)的表达,同时呈浓度依赖性促进CD3 1的表达,见表2。光镜结果显示,对照组光镜下表现为铺路石样,连接比较紧密, TGF-β1 刺激72 h后细胞形态转化为狭长形,连接较松散, TGF--β1 与槲皮素( 100 μmol/ /L)共同刺激 72 h,h细胞形态又重新变为铺路石样,连接较

4.3 槲皮素对人脐静脉内皮细胞-12 CD3 D31 和vimentin 蛋白表达的影响

免疫荧光双染结果显示,对照组内皮细胞标志物

CD31 高表达,间质标志物 vimenntin 则表达较低,

TGF-β1 协同刺激 HUVVEC-12 细胞72h 后, CD D31 表达显著降低,而 vimenntin 表达则显著上调, T GF-β1与槲皮素( 100 μmol/L) )共同刺激 727 h后,可显著逆转这种转变,单加槲皮素时CD31 和vimentin 的表达与对照组相似,见图 2;Western bloot 结果也同样证实了这种转变,见图3、表3。

4.4 槲皮素对转化生长因子-β1//smadss信号通路及下游转录因子的影响

TGF-β 1 刺激 HUV VEC-12 24 h 后可显著诱导smad2/3 磷酸化水平升高,而槲皮素则可呈浓度依赖性的抑制 sm mad2/3 的磷酸化,见图4、表 4;T GF-β1刺激后,下游调控内皮-间质转化的重要转录因子 紧密,单用10 00 μmol/L 槲皮素刺激72 2h细胞形态与对照组相似,见图1。 sn ail1、twist1、twist2、ZE EB1、ZEB2 均明显升高,而槲皮素( 100 μmol/μ L)则可显著下调下游的5种转录因子;单用槲皮素( 100 μ μmol/L)对以上信号通路及转录因子则无影响,见表5。

5 讨论

内皮细胞通过内皮-间质转化机制转化的成纤维细胞在心肌纤维化中发挥着重要作用。本研究发现,

TGF-β1 连续刺激 HUVEC-12 72 h可诱导其转化为成纤维细胞表型,表现出更多的间质标记物升高,而内皮标记物降低。Western blot 结果显示,槲皮素可能通过抑制 TGF-β1/Smads 信号通路以及其下游的转录因子发挥抑制内皮-间质转化作用。以上结果均提示,槲皮素可抑制 TGF-β1 诱导的 HUVEC-12 发生内皮-间质转化而发挥抗纤维化的作用。

上皮-间质转化是上皮细胞失去上皮特性获得间质细胞表型的一种生物现象,发生上皮-间质转化后细胞 E-钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表达降低, vimentin、fibronectin、N-钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。研究表明,上皮-间质转化参与肿瘤侵袭转移,在肿瘤转移过程中,癌细胞通过上皮-间质转化而获得间质细胞表型和侵袭性,实现对周围组织的浸润,在种植部位,癌细胞通过间质-上皮细胞转化最终形成与原发灶形态结构相似的转移灶,内皮-间质转化是上皮-间质转化的一种形式,近年来,随着对器官纤维化发生发展机制的研究逐步深入,内皮-间

[6]质转化逐渐受到研究者的关注 。在器官纤维化进展到一定阶段时,小血管内皮细胞会逐渐转变为合成和分泌功能活跃的成纤维细胞,再进一步转化为肌成纤

[2]维细胞,完成内皮-间质转化的转变。Zeisberg EM等于 2007 年首次发现在压力负荷诱导的小鼠心肌纤维化中,内皮细胞通过内皮-间质转化现象转变为成纤维细胞,对心肌纤维化起到一定的促进作用,抑制内皮-间质转化则可显著改善心肌功能,表明内皮-间质 转化对心肌纤维化具有重要作用。

本研究以 TGF-β1 诱导的 HUVEC-12 建立内皮-间质转化模型,明确间质微环境在内皮细胞内皮-间质转化中的作用,明确内皮-间质转化过程与信号通路之间关系,采用 10 ng/mL TGF-β1 连续刺激

HUVEC-12 72 h,细胞形态由铺路石样转化为狭长形的成纤维细胞性状,细胞之间的连接也从紧密连接转换为松散连接,细胞间缝隙增大, RT-PCR 检测结果显示,间质标记物 Collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、fibronectin 均表达上调,而内皮细胞标记物 CD31 则表达下调,由此可以判断 TGF-β1 可诱导 HUVEC-12发生内皮-间质转化,而 TGF-β1 与槲皮素同时干预

HUVEC-12 72 h则可呈浓度依赖性逆转内皮-间质转化现象,上调内皮细胞标记物,下调间质标记物,免疫荧光双染结果也得到同样结果。内皮-间质转化是内皮细胞来源的内皮细胞获得具有迁移和侵袭能力间质细胞的重要生物学过程。因而,阐明调控内皮细胞发生内皮-间质转化过程的分子机制,明确其在心肌纤维化发生、发展过程中的病理意义,并探索基于内皮-间质转化关键分子的诊断方法及靶向内皮-间质转化关键分子的治疗手段是心肌纤维化中内皮-间质转化机制研究的关键问题。

TGF-β1/Smads 信号通路及其下游的一些转录因子在心脏内皮-间质转化中发挥着重要的调控作用,这些包括 snail 和 twist 锌指转录因子家族成员以及

[7-9]

ZEB 家族 。本研究检测了 TGF-β1/smads 信号通路及其下游的靶分子的表达,包括 snail1、twist1、twist2、

ZEB1、ZEB2,结果发现, TGF-β1 刺激 HUVEC-12

24 h可显著引起 smad信号通路的磷酸化水平升高,

其下游的靶分子 snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均表达上调,而 TGF-β1 与槲皮素( 100 μmol/L)联合作用时,则可显著降低 smad 信号通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此,我们认为槲皮素可能通过抑制 TGF-β1/smads信号通路以及其下游的靶分子表达抑制 HUVEC-12 发生内皮-间质转化现象。

槲皮素作用机制复杂,几乎涉及组织器官纤维化的各个环节: ①抑制成纤维细胞增殖; ②抑制胶原合成; ③抗氧化损伤;④抑制内皮细胞生长,抑制血管形成; ⑤影响细胞周期,诱导细胞凋亡。本研究结果表明,槲皮素可抑制 TGF-β1 诱导的 HUVEC-12 发生内皮-间质转化环节,为进一步探讨槲皮素的临床治疗提供了实验依据。此外,本研究也探讨了槲皮素对内皮-间质转化的作用并鉴定其可能作用的信号通路及转录因子,但未能阐明其具体的作用机制,也未能在大体动物模型中进一步验证,有待进一步完善相关实验,明确其作用机制。

参考文献:

[1] VASAN R S, BENJAMIN E J. Diastolic heart failure—no time to relax[J]. N Engl J Med,2001,344(1):56-59.

[2] ZEISBERG E M, TARNAVSKI O, ZEISBERG M, et al. Endothelial to mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis[J]. Nat

Med,2007,13(8):952-961.

[3] 罗莉莎,刘苏.槲皮素抗纤维化作用机制研究进展[J].国外医学:中医

中药分册,2005,27(6):330-332.

[4] 徐向进,张荔群,王庆彪,等.槲皮素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].

中华内分泌代谢杂志,2001,2(5):316-319.

[5] PHAN T T, LIM I J, CHAN S Y, et al. Suppression of transforming growth factor beta/smad signaling in keloid-derived fibroblasts by quercetin:implications for the treatment of excessive scars[J]. J Trauma,2004,57(5):1032-1037.

[6] KALLURI R, NEILSON E G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis[J]. J Clin Invest,2003,112(12):

1776-1784.

[7] FENG X H, DERYNCK R. Specificity and versatility in TGF-beta signaling through Smads[J]. Annu Rev Cell Dev Biol,2005,21(13):

659-693.

[8] VALCOURT U, KOWANETZ M, NIIMI H, et al. TGF-beta and the Smad signaling pathway support transcriptomic reprogramming during epithelial-mesenchymal cell transition[J]. Mol Biol Cell,2005,

16(4):1987-2002.

[9] SATO M, MURAGAKI Y, SAIKA S, et al. Targeted disruption of

TGF-beta1/Smad3 signaling protects against renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction[J]. J Clin Invest,2003,112(10):1486-1494.

(收稿日期: 2016-03-01) (修回日期: 2016-03-26;编辑:华强)

Newspapers in Chinese (Simplified)

Newspapers from China

© PressReader. All rights reserved.