活血止痛纳米凝胶贴膏经皮渗透特性及药效评价

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin -

1,2 2 2 2 2 3 2 2 2姚瑶 ,冯伟红 ,王岚 ,易红 ,梁日欣 ,何爱萍 ,殷晓杰 ,杜茂波 ,刘淑芝

1.首都医科大学,北京 100069;2.中国中医科学院中药研究所,北京 100700;

3.江西中医药大学,江西 南昌 330004

摘要:目的 研究微乳/醇质体对活血止痛凝胶贴膏的经皮渗透特性及对药效的影响。方法 采用改进的Franz扩散池法进行体外透皮试验,以离体小鼠皮肤为透过屏障,采用超高效液相色谱法测定指标成分丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯的含量,评价活血止痛凝胶贴膏的经皮渗透效果。并采用小鼠醋酸扭体实验比较其抗炎镇痛作用。结果 凝胶贴膏、微乳凝胶贴膏和醇质体凝胶贴膏丹皮酚24 h累计透过率分别为 65.30%、61.30%、

60.20%,丁香酚 24 h累计透过率分别为 51.08%、54.71%、55.66%,水杨酸甲酯24 h累计透过率分别为 49.20%、

65.17%、72.15%。微乳凝胶贴膏大剂量组、醇质体凝胶贴膏中剂量组对减少模型动物腹腔内毛细血管的炎性渗出、降低毛细血管通透性有较好的作用( P< 0.05)。结论 基于微乳/醇质体技术的复合型纳米载体可使活血止痛凝胶贴膏中有效成分透过皮肤屏障的能力更优,从而提高药效。

关键词:活血止痛凝胶贴膏;微乳;醇质体;透皮试验;抗炎;镇痛

DOI: 10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.018中图分类号: R283.5 文献标识码: A 文章编号: 1005-5304(2017)02-0070-06 Evaluation on Transdermal Absorption Properties and Efficacy of Huoxue Zhitong

Cataplasm YAO Yao1,2, FENG Wei-hong2, WANG Lan2, YI Hong2, LIANG Ri-xin2, HE Ai-ping3, YIN Xiao-jie2, DU Mao-bo2, LIU Shu-zhi2 (1. Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 3. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

Abstract: Objective To study the effects of microemulsion/ethosomes on transdermal absorption properties and efficacy of Huoxue Zhitong Cataplasm. Methods The improved Franz diffusion cells were used for the in-vitro permeation experiment with rat skins as the barriers, which was used to evaluate the transdermal absorption properties. In the erxeriment, the contents of paeonol, eugenol and methyl salicylate were used as markers, and detected by ultra performance liquid chromatography to evaluate the transdermal absorption effects. The anti-inflammatory and analgesia activity were evaluated through the writhing plate experiments. Results The cumulative release rate of paeonol in Huoxue Zhitong Cataplasm, Microemulsion Huoxue Zhitong Cataplasm and Ethosomes Huoxue Zhitong Cataplasm were, in order, 65.30%, 61.30% and 60.20% in 24 h; eugenol were, in order, 51.08%, 54.71% and 55.66% in 24 h; methyl salicylate were, in order, 49.20%, 65.17% and 72.15% in 24 h. Furthermore, Microemulsion Huoxue Zhitong Cataplasm high-dose group and Ethosomes Huoxue Zhitong Cataplasm medium-dose group had good effects on reducing the inflammatory exudate of peritoneal capillary and capillary permeability ( P< 0.05) in animal models. Conclusion Huoxue Zhitong Cataplasm based on microemulsion/ ethosomesnano-technology has good transdermal absorption properties and efficacy.

Key words: Huoxue Zhitong Cataplasm; microemulsion; ethosomes; transdermal experiment; anti-inflammatory; analgesia activity 基金项目:国家科技重大专项-重大新药创制(2014ZX09301306009)通讯作者:刘淑芝,E-mail:liushuzhi2004@sina.com

活血止痛膏由干姜、陈皮、丁香、胡椒、荆芥、牡丹皮、水杨酸甲酯等 28 味中药组成,具有活血止痛、舒筋活络功效,主治筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核

[1]

流注、关节酸痛 。原剂型为橡胶膏剂,上市多年,疗效确切,被广泛使用。由于橡胶膏剂透气性差、易致敏[ 2],故将其改为凝胶贴膏。活血止痛膏处方均含有挥发油等脂溶性成分,而凝胶贴膏是以水溶性高分子材料为基质的外用贴剂,为保证处方药与基质的高度融合,提高制剂稳定性,本研究以凝胶贴膏为载体,

[3-5]

微乳/醇质体 为释药系统,制备复合型纳米经皮给药制剂,在解决脂溶性成分与水溶性基质相容性的同时,利用微乳、醇质体纳米化的优势,促进药物经皮渗透。以方中脂溶性成分丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯为定量指标,考察体外经皮渗透特性和对药效的影响,评价微乳、醇质体在中药复方经皮给药制剂中应用的可行性。

1 仪器、试药与动物

Waters Acquity HPLC H-Class Core System 超高效液相色谱仪, BSA224S CW型电子分析天平(德国赛多利斯公司), TK-20B 型 Franz 扩散池(上海锴凯有限公司),透析袋(截留相对分子质量 7000,北京经科宏达生物技术有限公司), Z92-BD 多功能搅拌器(天津利华仪器厂)。

活血止痛凝胶贴膏(自制,批号 160615),微乳活血止痛凝胶贴膏(自制,批号 160626),醇质体活血止痛凝胶贴膏(自制,批号 160626);丹皮酚对照品(批号 D-002-140728)、丁香酚对照品(批号

D-064-140728 )、 水 杨 酸 甲 酯 对 照 品 ( 批 号

S-018-150728),成都瑞芬生物科技有限公司;甲醇、乙腈为 HPLC 级(美国, Fisher 公司),水为屈臣氏蒸馏水,冰醋酸(北京化工厂,批号 20150704),伊文思蓝(上海化学试剂厂,批号 030712),其余试剂均为分析纯。

昆明种小鼠,雄性,透皮试验小鼠体质量14~16 g、

4~5 周龄,药效学试验小鼠体质量 20~22 g、6~7周龄,中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,饲养于 SPF级动物房,动物许可证号SCXK(军)

2012-0004。

2 方法与结果 2.1 方法学考察

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯对照品适量,置25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,配成浓度分别为1.48、、8.92 18.2 mg/L的混合对照品储备液。精密量取该储备液 1 mL 于

10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取活血止痛凝胶贴膏体外透皮接收液,过0.20 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取凝胶贴膏空白基质体外透皮接收液,过 0.20 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

2.1.4 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱: Acquity ®

UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 m);流动相:乙腈( A)-0.1%甲酸水( B),梯度洗脱( 0~4 min,

10%~90%A);检测波长: 280 nm,柱温: 30 ℃,流速: 0.6 mL/min。在上述色谱条件下,对照品溶液、供试品溶液中丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯均分离良好,阴性对照溶液无干扰。色谱图见图1。

2.1.5 线性关系考察 取混合对照品溶液 3 mL 置

10 mL容量瓶中,加甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,进样 1 L,再将混合对照品储备液分别进样0.1、0.5、

1.0、、2.5 5.0 L,按“2.1.4”项下色谱条件进样,测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯的峰面积,并以各成分的进样质量( ng)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。结果显示, 3 种待测成分在确定的线性范围内线性关系良好,见表1。

2.1.6 日内精密度试验 分别精密吸取 2、1、12 h接收液,为高、中、低浓度,于1d内连续进样6次,分别测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯峰面积,结果显示各成分RSD均在3%以下,表明仪器精密度良好,见表 2。

2.1.7 日间精密度试验 分别精密吸取 2、1、12 h接收液,为高、中、低浓度,于3d内每日分别连续进样 6次,分别测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯峰面积,结果显示各成分RSD 均在 3%以下,表明仪器精密度良好,见表2。

2.1.8 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24、48 h进样,测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯峰面积,结果RSD 分别为 1.4%、

1.2%、0.24%,表明供试品溶液在48 h内稳定,见表2。

2.1.9 重复性试验 精密吸取 6 份供试品溶液,注入超高效液相色谱仪中,分别测定丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯含量, RSD 分别为 1.3%、1.6%、1.2%,表明方法的重复性良好,见表2。 2.1.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的接收液 5 mL,按样品含量∶对照品加入量大致为1∶1比例加入丹皮酚、丁香酚和水杨酸甲酯混合对照品溶液,加甲醇定容至10 mL,按“2.1.4”项下色谱条件进行测定,结果丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯的平均加样回收率分别为 98.44%、102.33%、101.93%,RSD分别为 1.68%、0.65%、1.90%,表明方法的准确度良好,结果见表3。

2.2 凝胶贴膏基质的制备

2.2.1 活血止痛凝胶贴膏的制备 精密称取处方量活血止痛浸膏和凝胶贴膏基质,混合均匀,制成膏体后均匀涂布于衬布上,加盖聚乙烯薄膜,即得活血止痛凝胶贴膏样品。活血止痛浸膏中丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯含量分别为1.42、11.19、125.36 mg/g 浸膏。

2.2.2 微乳活血止痛凝胶贴膏的制备 按处方比例称取活血止痛浸膏、樟脑、薄荷脑、冰片、水杨酸甲 酯与适量中链甘油三酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙二醇,按微乳制备工艺混合,使药物溶解完全,于室温采用磁力搅拌器边搅拌边加入处方量的水至澄清透明,即得 O/W 型载药活血止痛微乳,用载药微乳溶胀辅料混合均匀,制成膏体后均匀涂布于衬布上,加盖聚乙烯薄膜,即得微乳活血止痛凝胶贴膏样品。 2.2.3 醇质体凝胶贴膏的制备 采用注入法制备活血止痛醇质体,称取处方量冰片、樟脑、薄荷脑、水杨酸甲酯加入胆固醇、磷脂、表面活性剂和维生素E油,注入一定量的乙醇,在密闭、温度 35 ℃、磁力搅拌条件下溶解完全后,将纯水缓慢加入乙醇溶液中,持续搅拌5 min,搅拌结束后将醇质体放至室温,经 0.20 μm微孔滤膜过滤,得醇质体。将醇质体与其他药材醇提物混合均匀,即得醇质体浸膏。称取处方量醇质体浸膏和基质,混合均匀,制成膏体后均匀涂布于衬布上,加盖聚乙烯薄膜,即得醇质体活血止痛凝胶贴膏样品。

2.3 体外经皮渗透试验

2.3.1 离体鼠皮的制备 小鼠断颈处死,适量脱毛剂脱去鼠毛,生理盐水冲洗干净,剥离皮肤,去除脂肪层、筋膜,置于生理盐水中,选取完整无破损皮肤。

2.3.2 经皮渗透试验 采用 Franz 扩散池,将活血止痛凝胶贴膏、微乳活血止痛凝胶贴膏、醇质体活血止痛凝胶贴膏分别设为 AB、 、C 组,每组精密称取凝胶贴膏 0.500 g/份,平行5份。将鼠皮固定在扩散池

与接收池之间,扩散面积为 3.14 cm2,接收液为PEG400-95%乙醇-生理盐水( 1∶3∶6),磁力搅拌转速为 350 r/min,控制温度为( 32±0.2)℃,计时,分别于1、2、4、8、12、24 h时间点将接收液全部取出,同时补加同体积的新鲜接收液。将接收液作为供试品溶液,过 0.20 μm微孔滤膜,采用超高液相色谱法( UPLC)测定供试品中丹皮酚、丁香酚、水杨酸甲酯的含量,分别按照公式计算其累计透过率( Q)。。式中, C

i为第 i 个时间点样品的质量浓度, V为每次取样的体积, W为所取 凝胶贴膏样品中待测成分的含量。以Q对透皮时间( t)作图,绘制体外透皮曲线。各成分经皮渗透动力学方程见表4~表 6,透皮曲线见图2~图。4

凝胶贴膏、微乳凝胶贴膏和醇质体凝胶贴膏丹皮酚 24 h累计透过率( Qp)分别为 65.30%、61.30%、

60.20%,丁香酚 24 h累计透过率( Qe)分别为 51.08%、

54.71%、55.66%,水杨酸甲酯24 h累计透过率( Qm)分别为 49.20%、65.17%、72.15%。不同释药载体的3种成分中只有水杨酸甲酯24 h累计透过率微乳/醇质体凝胶贴膏具有明显优势,见图5。

2.4 不同释药载体活血止痛凝胶贴膏药效学比较

2.4.1 给药剂量 本品为已上市产品改剂型,处方剂量不变,折算成小鼠大、中、小剂量为 0.52、0.26、

0.13 g 原药材/kg。根据每组剂量计算给药面积,大、中、小剂量分别为 1.29、0.645、0.33 cm2/20 g 体质量。制备ABC、 、 样品贴膏,分别为活血止痛凝胶贴膏、微乳活血止痛凝胶贴膏、醇质体活血止痛凝胶贴膏。

2.4.2 分组与给药 动物随机分为11组,对照组(空白基质膏贴),阳性药组(涂抹双氯芬酸二乙胺乳胶剂 0.1 g/20 g体质量), A样品大、中、小剂量组, B样品大、中、小剂量组, C样品大、中、小剂量组,每组 11 只。3种样品均按上述剂量给药,每日1次,贴于小鼠背部皮肤,固定, 4~6 h去除药膏,清洁皮肤,连续3d。

2.4.3 观察指标

2.4.3.1 扭体次数 于第 3日给药后 40 min,动物腹腔注射 0.6%醋酸 0.1 mL/10 g体质量,观察20 min内各组出现扭体反应的次数,以腹腔内凹、伸展后肢、臀部抬高为阳性指标。计算20 min 内小鼠扭体反应次数及药物对扭体反应的抑制率[ 6],抑制率( %)= (对照组扭体均数-药物组扭体均数)÷对照组扭体

均数×100%。

2.4.3.2 腹腔液吸光度 于给药后 1 h,小鼠静注

0.5%伊文思蓝生理盐水溶液 0.1 mL/10 g体质量,

20 min 后脱颈椎处死,剪开腹部皮肤肌肉, 5 mL生理盐水分数次洗涤腹腔,吸管吸出洗涤液合并,

3000 r/min 离心 15 min,取上清液,于 590 nm波长处

[6]

比色测定光密度( OD)值。

2.4.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以x± s表示,多组间比较采用方差分析。

P< 0.05表示差异有统计学意义。

2.4.5 药效试验结果 不同释药载体活血止痛凝胶贴膏镇痛抗炎作用比较见表7。

阳性药组、微乳凝胶贴膏大剂量组、醇质体凝胶贴膏中剂量组 OD 值明显低于对照组,差异有统计学意义( P< 0.05, P< 0.01);阳性药组和凝胶贴膏大、中剂量组,微乳凝胶贴膏中、小剂量组,醇质体凝胶贴膏小剂量组扭体次数均明显低于对照组,差异有统计学意义( P< 0.05),扭体抑制率在

50%以上。微乳凝胶贴膏大剂量组、醇质体中剂量组对减少小鼠腹腔内毛细血管的炎性渗出,降低毛细血管通透性有较好作用( P< 0.05),各样品之间作用未见明显差异。

3 讨论

凝胶贴膏、微乳凝胶贴膏和醇质体凝胶贴膏丹皮酚 24 h累计透过率分别为 65.30%、61.30%、60.20%,丁香酚 24 h 累计透过率分别为 51.08%、54.71%、

55.66%,经 t检验,二者组间比较差异均无统计学意义( P> 0.05);水杨酸甲酯 24 h 累计透过率分别为

49.20%、65.17%、72.15%,凝胶贴膏与醇质体凝胶贴膏组间比较 P< 0.01,微乳凝胶贴膏与醇质体凝胶贴膏组间比较 P< 0.01,凝胶贴膏与微乳凝胶贴膏组间比较 P> 0.05,三者比较,纳米载体对水杨酸甲酯促进经皮渗透效果明显。丹皮酚、丁香酚组间比较差异无统计学意义,可能与其分子量小且均具有芳香走窜

[7-8]特性,容易经皮渗透等因素有关 。其透皮特性基本符合 Higuchi 模型特点。0~4 h经皮渗透过程符合零级过程, 4h 后透皮速率减慢且非恒速,可能是皮肤表面药物浓度降低,皮肤远端药物扩散缓慢达不到前 4h制剂中的药物浓度所致。

从药效试验结果可以看出:不同释药载体的活血止痛膏贴均能不同程度降低由化学刺激引起的腹腔疼痛,减少小鼠扭体次数,提高扭体反应抑制率;且微乳凝胶贴膏大剂量组、醇质体凝胶贴膏中剂量组对减少小鼠腹腔内毛细血管的炎性渗出、降低毛细血管通透性具有较好作用( P< 0.05)。说明将药物纳米化可提高某些药物的累计透过率及透皮速率,从而提高

[9-11]

药效 。

将活血止痛膏制成纳米释药载体,增加了药物在整个体系中的溶解度[12- 13],药物以分子形式容易透过皮肤。同时,微乳或醇质体将脂溶性成分转化为水溶性,在解决水性凝胶与之相容性并提高了制剂稳定性

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