应用ITS2条形码鉴定藏药镰形棘豆

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Traditional Chin - 基金项目:甘肃省中医药科学技术研究课题(GZK-2012-71); 甘肃省自然科学基金(1506RJZA143);甘肃省中医院博士科研启动经费课题(博 2013-9)

黄聪琳,郭敏,王晓琳,姜华

甘肃省中医院,甘肃省中医药研究院,甘肃 兰州 730050

摘要:目的 对藏药镰形棘豆及其易混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量及临床疗效。方法 提取样本基因组DNA,对核基因 ITS2 片段进行PCR扩增并测序,并对所得序列进行同源性比较,利用MEGA 软件进行相关数据分析,并构建基于ITS2 序列的邻接( NJ)树。结果 镰形棘豆物种种内K2P遗传距离为0,与其他混伪品的 K2P 遗传距离分布于 0.068~0.084,构建的 NJ 树表明 ITS2 序列能够区分镰形棘豆与其他易混伪品。结论 ITS2 序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别镰形棘豆及其易混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。

关键词:镰形棘豆; DNA条形码; ITS2;分子鉴定

DOI: 10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019

中图分类号: R282.5 文献标识码: A 文章编号: 1005-5304(2017)02-0076-03

Application of ITS2 Barcoding in Identification of Oxytropis Falcate Bunge HUANG Cong-lin, GUO Min, WANG Xiao-lin, JIANG Hua (Gansu Provincial Hospital of TCM, Gansu Academy of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China)

Abstract: Objective To identify Oxytropis falcate Bunge from its adulterants; To secure the quality and clinical efficacy of Oxytropis falcate Bunge. Methods Genomic DNA was extracted. ITS2 fragment of nuclear gene was amplified and sequenced. The homology of the sequences was analyzed, and the related data were analyzed by software MEGA. The NJ (neighbor-joining) tree was constructed based on ITS2 sequence. Results The intraspecific genetic distance of Oxytropis falcate Bunge (K2P distance) was 0, and the interspecific genetic distance (K2P distance) between Oxytropis falcate Bunge and its adulterants ranged among 0.068-0.084. The constructed NJ tree showed that ITS2 could identify Oxytropis falcate Bunge from its adulterants correctly. Conclusion ITS2 barcode can be used to identify Oxytropis falcate Bunge from its adulterants effectively, and this study provides important molecular evidence for the identification of Oxytropis falcate Bunge and safety in its clinical use.

Key words: Oxytropis falcate Bunge; DNA barcoding; ITS2; molecular identification

镰形棘豆 Oxytropis falcate Bunge 是我国青藏高原常用的民间草药之一,收载于 1995 年颁布的《卫生部药品标准》藏药第一册。全草入药,具有清热解

[1]毒、生肌愈疮、涩脉生血、通利大便等功效 。由于其突出的抗炎疗效,被誉为藏医“三大抗炎药”之一,是奇正消痛贴膏、青鹏膏剂、流感丸、藏红花油、棘豆扶正胶囊等多种藏药复方或成药的主要药物。王栋

[2]

等 实验研究显示,镰形棘豆具有良好的外周镇痛活性,对急性炎症和慢性炎症都有较好的作用。其黄酮

[3]类成分具有抗炎与抗氧化活性 。有研究报道,镰形棘豆活性成分对胃癌、肝癌细胞株具有较强的细胞毒

[4-5]

活性 。镰形棘豆对中波紫外线照射所致人角质形

[6] [7]成细胞损伤具有保护作用 。戴衍朋等 以小鼠为研究对象,发现镰形棘豆具有较好的止血、促凝血作用。

但至目前为止,对藏药镰形棘豆生药鉴定方面的研究还非常薄弱,并且只见于利用传统方法进行鉴

[8]

定 。棘豆属近缘种植物,尤其是同生境分布的近缘种,产地来源相同、表型具有趋同性、形态特征相似,往往很难通过传统的基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定等方法进行准确鉴别。因此,本研究提出采用 DNA条形码( DNA barcoding)的方法对镰形棘豆及其易混伪品砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆等进行分子鉴定。

DNA条形码技术利用短的、标准的DNA序列片

[9]

段对物种进行分子鉴定 。因其是基于物种基因的检测,而不是与环境密切相关的表现型,避免了人为因

素和客观条件的影响,为生药鉴定提供了本质依据,

[10]适用于对中药材进行真伪鉴定 。ITS2 序列位于 5.8S和 28S rRNA之间,在物种水平的变异较快,已被用

[11-13]于多个物种的 DNA 条形码鉴定 。本研究利用

ITS2条形码对镰形棘豆及其易混伪品进行比较研究,旨在为该药材的质量控制、临床安全用药及合理开发利用提供分子依据。

1 仪器与试药

共20个样本,来自7个物种,包括样品及Genbank下载序列。样品由兰州大学生命科学学院副教授盛红

2 方法 2.1 样品总 DNA 提取 2.2 目的序列 PCR 扩增

称取 100 mg样品组织,在预冷的研钵中进行快速充分研磨,然后利用天根植物基因组 DNA 提取试剂盒提取总DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测后,置4 ℃冰箱保存备用。

ITS2序列扩增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG

AAT-3',反向 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反应体系 25 μL,包括: DNA 模板 0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,dNTP mix 0.5 μL,引物各 0.5 μL,Taq酶 0.5 μL, ddH2O 20 μL。扩增程序: 95 ℃预变性

5 min;94 ℃变性 30 s,55 ℃复性 30 s,72 ℃延伸

1 min,30 个循环; 72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。 梅进行鉴定,凭证标本保存于甘肃省中医药研究院中药研究所。样品及 GenBank 下载序列见表1。

低温高速离心机( Eppendorf,德国),恒温水浴锅(科哲,中国上海), PCR 仪( Bio-Rad,美国),水平电泳仪( Bio-Rad,美国),凝胶成像系统( Bio-Rad,美国)。

植物 DNA提取试剂盒、dNTP Mix、PCR buffer ( 10×)、Taq酶,北京天根生物技术有限公司;定量Marker DS2000,广东东盛生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,由上海生工生物工程有限公司完成测序。

2.3 数据处理与分析

对测序峰图进行校对,去除引物区,使用基于HMM的注释方法[ 14],去除两端 5.8s 和 28s 区段,获得 ITS2间隔区序列。将所有序列用 Clustal X软件进行多序列比对,利用 MEGA 软件分析比对,并基于K2P模型计算序列间进化距离,用邻接( NJ)法构建系统聚类树。利用自展 Bootstrap 检验评价各分支的支持率, 1000 次重复。

3 结果

3.1 PCR产物电泳检测

采用ITS2序列引物对采集样本基因组DNA进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

3.2 .2 种内与种间变异分析

20 个样本的 ITS2 序列平均长度为211 bp;GC含量差异较小,分布于 51.2% % ~ 52.8%,平均GC含量为

51 .8%。K2P 遗传距离分析表明,镰形棘豆种内的遗传距离为0,镰形棘豆与其易混伪品种间平均K2P距离为0.075,分布于 0.068~ ~ 0.084。

3.3 .3 聚类分析

基于 ITS2序列,利用软件 MEGA A 构建的 NJ系统聚类树(见图2)显示,不同来源的镰形棘豆样本聚为一支,表现出单系性,自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆也分别聚为独立的支,与镰形棘豆区分明显。

4讨论

由于棘豆属一些物种形态相似,镰形棘豆与相同生境的同属近缘植物难以辨识。棘豆属其他植物如甘肃棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16 6],采食有毒棘豆属植物后常会引发动物发生中枢神经抑制、呼吸抑

[1 7]制,引起中毒乃至死亡,或导致动物流产、畸形 。伪品混用严重影响真品镰形棘豆的用药安全,因此,对镰形棘豆药材的准确鉴定至关重要。本研究发现, ITS2 作为 DNA条形码序列,可以有效便捷地鉴别镰形棘豆与砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆等易混伪品,具有重要的应用价值。

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图 2 ITS2 条形码构建的镰形棘豆及其易混伪品的 NJ 树

注: 1.SN140726;2. .SN140723;3.SN N140722;4.SN14 40718;5.SN1407 17; 6.6 SN140708;7.SN N140706;8.SN14 40704;9.SN1407 703;10.SN14070 01

图 1 PCR扩增电泳图

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