基于核磁共振氢谱的膝关节骨性关节炎肝肾亏虚证血清代谢组学研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

邵勤,周小莉,张莹,吴斌,王莎莎

重庆市中医院,重庆 400021

摘要:目的 研究膝关节骨性关节炎(KOA)肝肾亏虚证的内源性代谢物,探讨KOA肝肾亏虚证辨证的物质代谢轮廓。方法 选取 KOA肝肾亏虚证和非肝肾亏虚证患者各50 例及 20例健康志愿者,空腹8 h后收集血清5 mL,采集核磁共振氢谱(1H-NMR),采用主成分分析法和偏最小二乘法判别分析的模式识别分析法进行多元统计分析。结果 1H-NMR 能识别的代谢物 23 种,KOA患者与健康志愿者比较差异有统计学意义

(P<0.05,P<0.01)。KOA肝肾亏虚证患者软骨基质代谢、能量代谢、脂类代谢、疼痛及炎症相关的代谢物

与非肝肾亏虚证组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 KOA肝肾亏虚证患者有独特的 1H-NMR 代谢轮廓,KOA辨证分型具有代谢物质基础。关键词:代谢组学;核磁共振氢谱;膝关节骨性关节炎;肝肾亏虚

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.007

中图分类号:R274.94 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0027-05

Metabolomic Study on Serum of Liver-Kidney Deficiency Syndrome of Knee-Joint

Osteoarthritis Based on 1H-NMR SHAO Qin, ZHOU Xiao-li, ZHANG Ying, WU Bin, WANG Sha-sha (Chongqing City Hospital of TCM, Chongqing 400021, China)

Abstract: Objective To study the endogenous metabolites of liver-kidney deficiency syndrome in knee-joint osteoarthritis (KOA) and explore the metabolic profile of KOA liver-kidney deficiency syndrome. Methods Totally

50 cases of KOA with liver-kidney deficiency syndrome and 50 cases of KOA with non-liver-kidney deficiency syndrome were collected respectively, and 20 cases of healthy volunteers were collected as the normal group. The serum samples of subjects were collected after fasting for 8 h. Hydro-Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) spectrometer was collected. Principal component analysis and partial least squares discrimination analysis were used to conduct multivariate statistical analysis. Results 1H-NMR could identify 23 kinds of metabolites, and there was statistical significance between KOA patients and healthy volunteers (P<0.05, P<0.01). There was statistical significance in cartilage matrix metabolism, energy metabolism, lipid metabolism, pain, inflammation-related metabolites in patients with KOA liver-kidney deficiency syndrome and patients with KOA non-liver-kidney deficiency syndrome (P<0.05). Conclusion Patients with KOA liver-kidney deficiency syndrome have a unique

1H-NMR metabolic profile, KOA syndrome has a metabolic material basis.

Key words: metabolomics; 1H-NMR; knee-joint osteoarthritis; liver-kidney deficiency

膝关节骨性关节炎( knee-joint osteoarthritis , KOA)是一种以进行性膝关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的中老年人的常见病和多发病,是引起膝关节疼痛甚至病残的常见原因,严重影响患者的生活质量和自理能力[1]。KOA属中医学“痹证”“骨痹”

基金项目:重庆市自然科学基金(cstc2011jjA10108);重庆市

卫生局中医药科技重点项目(ZY20131024)

通讯作者:周小莉,E-mail:tiny1976@163.com 等范畴,中医治疗 KOA 疗效显著[2-3]。“证”是中医辨证论治的起点和核心,但其理论的科学性一直缺乏有力的直接证据,这也是长期阻碍中医学发展的难

题[4]。近年来,基于核磁共振氢谱(1H-NMR)的代谢组学检测方法为中医证候客观化研究提供了新的

思路和手段[5]。本研究采用 1H-NMR 代谢组学检测技术分析 KOA 肝肾亏虚证患者血清的代谢组学变化,寻找 KOA 肝肾亏虚证的代谢轮廓,为其“证”的本质研究提供物质基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院 2014 年 1 月-2016 年 3 月 KOA患者。肝肾亏虚证患者 50 例,其中男 16 例,女 34 例;年龄 55~75 岁,平均年龄(62.8±6.9)岁;病程最短 3个月,最长20 年,平均病程(3.9±3.1)年。非肝肾亏虚证患者50 例,其中男 15 例,女 35 例;年龄 55~

75 岁,平均年龄(62.7±8.6)岁;病程最短 1个月,最长 11 年,平均病程(3.5±2.9)年。正常组选取本院门诊体检的健康志愿者20 例,其中男7 例,女 13

例,平均年龄(61.9±4.1)岁。3 组性别、年龄、体

质指数(BMI)比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性;非肝肾亏虚证组、肝肾亏虚证组病程、

西安大略-麦克马斯特(WOMAC)[6]评分比较,差异

无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表 1。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 西医诊断标准

[7]采用 2010年《骨关节炎诊断及治疗指南》 KOA

标准。患者符合分类标准(1)(2)均可。

(1)临床标准:①近 1 个月大多数时间有膝关

节疼痛;②有骨摩擦音;③晨僵时间≤30 min;④年

龄≥38岁;⑤有骨性膨大。满足①②③④或①②⑤或①④⑤即可诊断。

(2)临床+放射学+实验室标准:①近 1 个月大多数时间有膝关节疼痛;②X线示骨赘形成;③关

节液检查符合骨性关节炎(OA);④年龄≥40岁;

⑤晨僵≤30 min;⑥有骨摩擦音。满足①②或①③⑤ ⑥或①④⑤⑥即可诊断。

1.3 中医辨证标准

采用《中药新药临床研究指导原则(试行)》[8]

及《中医内科常见疾病诊疗指南》[9]中肝肾亏虚证辨证标准。主症:关节疼痛,腰膝酸软,痿弱乏力。次症:骨节肥大,活动不利,运动牵强。舌质淡红,苔薄白,脉滑或弦。

1.4 纳入标准

①年龄 55~75 岁;②患者符合上述西医诊断标准;③肝肾亏虚证组符合肝肾亏虚证辨证标准;④近4 周未使用糖皮质激素及近 2 周内未用其他方法治疗;⑤所有受试者均签署知情同意书。

1.5 排除标准

①患有影响关节的疾病,如类风湿关节炎、银屑病、代谢性骨病及急性创伤等;②合并心脑血管、肝、肾、造血系统及内分泌系统等严重原发性疾病;③精神病患者。

2 方法

2.1 血清样本收集与处理

患者及健康志愿者均空腹8 h,8:00-10:00 空腹静息状态下采集静脉血5 mL。3000 r/min 离心 10 min,收集血清于EP 冻存管中,-80 ℃冰箱保存,备用。

2.2 检测样本制备

在 1H-NMR 检测前,-80 ℃冰箱取出血清,梯度解冻。取 300 —L 血清置离心管中,加入0.2 mol/L 磷

酸盐缓冲液(0.2 moL/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH7.4)

200 —L,4 ℃、14 000×g 离心 10 min,取上清液,置于 5 mm核磁管中,再加入100 —L氘代重水,震荡

混匀,4 ℃冰箱保存备用。

2.3 核磁共振氢谱数据采集与处理

使用 Bruker UltraShield™500 MHz核磁共振波谱仪,采用 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 自旋回波序列结合预饱和方法采集信号。自由感应衰减(FID)采样点为 32 k,采集累加次数128,控制温度在 298 K。信号经过 32 k傅立叶变换转为NMR图谱。将图谱文件夹导入 MestReNova 10.0 分析软件进行分析、积分,积分区间为δ 0.5~9.0,积分间隔 0.004 ppm,为消除剩余水峰引起的影响,将δ 4.6~5.1 区域设为零积分分段。对所产生的积分数据进行归一化处理。

2.4 模式识别分析

将数据导入 SIMCA-P12.0 软件进行多元统计分析,进行主成分分析(PCA)。为消除相关因素(如个体差异)对分组的影响,强化组间差异,进一步采用正交信号校正处理,再行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)的模式识别分析。分析结果以得分图表示,直观给出各样本分布。

2.5 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,组间比较采用独立样本 t 检验;计数资料—

组间比较采用卡方检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

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