六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

刘秋雨1,裴日周 2,钱林林 2,连增林 3

1.北京中医药大学中药学院,北京 100102;2.天地散生物医药科技开发(北京)有限公司,北京 100080;

3.北京亦创生物技术产业研究院生物中药研究所,北京 101111

摘要:目的 观察六氧化四砷(As4O6)对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,探讨其作用机制。方法 体外培养人乳腺癌 MCF-7 细胞,不同浓度 As4O6对细胞进行干预。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,半定量RT-PCR 检测细胞周期蛋白 E1(Cyclin E1)、细胞周期蛋白 A2(Cyclin A2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p21 和基质金属蛋白酶-9(MMP-9) mRNA 表达情况。结果 As4O6 对 MCF-7 细胞增殖有明显抑制作用,且呈剂量依赖性(P<0.01);与对照组

(0 μmol/L)比较,As4O6浓度为 9、12、15 μmol/L 时,MCF-7 细胞凋亡率明显增加(P<0.05,P<0.01);

As4O6高(3 μmol/L)、低(1 μmol/L)浓度均可有效抑制 MCF-7 细胞的迁移能力(P<0.01);随 As4O6浓度增加,Cyclin E1、Caspase-3、p21 mRNA 表达明显升高,Cyclin A2、MMP-9 mRNA 表达明显降低(P<0.05,P<

0.01)。结论 As4O6对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖、周期、侵袭及迁移能力有明显抑制作用,其机制可能与增强Cyclin E1、Caspase-3、p21 及抑制 Cyclin A2、MMP-9 mRNA表达有关。关键词:六氧化四砷;乳腺癌细胞;细胞凋亡;细胞增殖;侵袭;迁移;细胞周期

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.011

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0044-05

Effects of Tetra-arsenic Oxide on Proliferation, Migration and Invasion of Human Breast Cancer MCF-7 Cells

LIU Qiu-yu1, PEI Ri-zhou2, QIAN Lin-lin2, LIAN Zeng-lin3 (1. School of Pharmaceutical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. Chonjisan Biological Medicine Technology Development (Beijing) Co., Ltd., Beijing 100080, China; 3. Institute of Biological Chinese Medicine, Beijing 101111, China)

Abstract: Objective To observe the effects of tetra-atsenic oxide (As4O6) on the proliferation, migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells; To explore its potential mechanism. Methods The human breast cancer

MCF-7 cells were regarded as the research object and cultured in vitro, with different concentrations of As4O6 using to intervene in MCF-7 cells. The cell proliferation was detected by MTT assay; the flow cytometry and wound-healing assay were used to detect the cell apoptosis and migration, respectively. The expressions of Cyclin E1, Cyclin A2, Caspase 3, p21 and MMP-9 mRNA were accessed by semi quantitative RT-PCR. Results As4O6 had a significant inhibitory effect on the proliferation of MCF-7 cells in a dose dependent manner. Compared with the control group

(0 μmol/L), the apoptosis rate increased significantly when the concentration of As4O6 was 9, 12, 15 μmol/L (P<0.01). Either As4O6 at high (3 μmol/L) or low (1 μmol/L) concentration could effectively inhibit the migration of MCF-7 cells (P<0.01). With the increasing concentration of As4O6, the expressions of Cyclin E1, Caspase 3, and p21 mRNA significantly increased, while the expressions of Cyclin A2 and MMP-9 mRNA significantly decreased (P<0.05,

P<0.01). Conclusion As4O6 can significantly inhibit the proliferation, cycle, invasion and migration of breast cancer

MCF-7 cells, and the mechanism may be related to the increase of expressions of cyclin E1, caspase 3, p21 and inhibition of expressions of cyclin A2 and MMP-9.

Key words: tetra-arsenic oxide; breast cancer cells; cell apoptosis; cell proliferation; invasion; migration; cell cycle 通讯作者:连增林,E-mail:zenglinlian@aliyun.com

砷剂是古老的抗肿瘤药物,以常见的氧化剂和硫化剂等形式存在。《本草纲目》载:“砒石又名信石、砒霜,可治烂肉、蚀瘀及腐瘰。”虽然砷剂被沿用至

今,但其毒性限制了其适用范围。三氧化二砷(As2O3)是最广为熟知的砷剂,临床用于急性早幼粒细胞白血

病及多种肿瘤的治疗。六氧化四砷(As4O6)对子宫

颈癌细胞[1]、人胃癌细胞[2]、上皮癌细胞[3]等均有一定抑制作用,但其对乳腺癌的干预研究鲜有报道。因此,本研究观察不同浓度 As4O6 对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖、凋亡、周期和侵袭、迁移能力的影响,为

As4O6干预乳腺癌的分子作用机制提供依据。

1 实验材料

1.1 细胞

人乳腺癌MCF-7细胞株,中国科学院上海细胞库。

1.2 药物及制备

As4O6,纯度 99.99%,韩国 Chonjisan Co., Ltd.公司。称取一定量As4O6溶解于水中,配制成5 mmol/L母液,过滤,室温保存备用,临用时以培养基稀释至不同浓度。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、MEM培养液, Hyclone 公司。MTT(Amresco)、二甲基亚砜(DMSO, Amresco)、青链霉素混合液(Solarbio)、RT-PCR 试剂盒和 Trizol,日本 TaKaRa 公司。Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司,引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计合成。FACSCalibur流式细胞仪(美国BD 公司),YT-CJ-2ND 型超净工作

台(北京亚泰),MCO-175 CO2培养箱(日本 SANYO),

BDS200倒置相差显微镜(奥特光学),MULTLSKAN

MK3酶标仪(美国 Thermo 公司),BIOMATE 型紫外可见分光光度计(美国Thermo 公司),GE4852 型 PCR仪(杭州柏恒科技有限公司),Champ Gel 5000 型全自动凝胶成像系统(北京赛智创业科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 MTT 法检测 MCF-7 细胞增殖

取对数生长期的人乳腺癌MCF-7 细胞株,0.25%胰酶消化后,用含10%FBS MEM培养液稀释成2.5×

104个/mL 细胞悬液,以 200 μL/孔接种于 96 孔培养

板,37 ℃、5%CO2培养箱中预培养24 h。分别设置空白孔、调零孔和 As4O6 给药孔。As4O6给药浓度分别为 4、8、16、32、64 μmol/L,200 μL/孔,每组设

6个复孔,继续培养24 h。每孔加 5 mg/mL MTT 溶液

20 μL,于培养箱内孵育 4 h,弃去培养液,每孔加

100 μL DMSO,室温振荡 15 min。待沉淀完全溶解后, 于酶标仪 570 nm 处测定光密度(OD)。计算细胞存活率(实验组OD值÷对照组OD 值×100%)。

2.2 流式细胞术检测 MCF-7 细胞凋亡

取对数生长期细胞,以 1×105个/mL密度接种于

培养瓶中,24 h后加入含 10%FBS MEM培养液稀释的各浓度 As4O6溶液(0、1、3、6、9、12、15 μmol/L)继续培养 24 h,收集所有细胞,严格按照 Annexin V-FITC 试剂盒说明书进行操作,流式细胞术检测

MCF-7 细胞凋亡。

2.3 划痕愈合实验检测 MCF-7 细胞迁移、侵袭能力

收集对数生长期 MCF-7 细胞,以 2.5×105个/mL密度接种于6 孔板中,2 mL/孔,置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。培养至细胞长满培养板后,吸弃上清液,用 10 μL 吸头在6孔板上划“一”字,PBS轻轻冲洗 2次。每孔分别加入不含FBS MEM培养液稀释的各浓度 As4O6溶液(0、1、3 μmol/L),各设 3 个复

孔,100 倍倒置显微镜下,分别于药物作用 0、24、

48 h拍照。计算划痕愈合率[(0 h 划痕面积-24/48 h

划痕面积)÷0 h 划痕面积×100%]。

2.4 RT-PCR 检测细胞周期、凋亡及迁移相关基因的表达

采用 Trizol两步法提取MCF-7细胞内的总RNA,测定 OD260/OD280值。按 TaKaRa RT-PCR 试剂盒说明合成 cDNA 第一链,以此 cDNA 为模板进行 PCR 反应。PCR 退火温度及循环数:β-actin 为 58 ℃、30 循

环,p21 为 60.5 ℃、40循环,细胞周期蛋白 E1(Cyclin

E1 )、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 ( Caspase-3 )为

58 ℃、30 循环,细胞周期蛋白 A2(Cyclin A2)为

57.7 ℃、40 循环,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)为

60.5 ℃、45循环。反应结束后,将PCR 产物于 1.5%琼脂糖凝胶电泳。引物序列见表1。

3 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析,实验数据以x±s 表示,多组间比较采用方差分析。P<0.05 表示—

差异有统计学意义。

4 结果 4.1 六氧化四砷对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖的影响

MTT 法结果显示,经不同浓度 As4O6 干预后,

MCF-7 细胞生长受到明显抑制,差异有统计学意义

(P<0.01)。随 As4O6浓度增加,MCF-7 细胞存活率逐渐降低,呈剂量依赖性,见图1。

4.2 六氧化四砷对乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡的影响

流式细胞术分别检测了不同浓度As4O6对MCF-7细胞的凋亡作用,Annexin V-FITC/PI 双参数检测显示,细胞机械损伤程度非常小,细胞因机械损伤的数

目很少(<1%)。当 As4O6 浓度为 1、3、6 μmol/L

时,细胞凋亡率均<10%,与对照组(0 μmol/L)比较,

差异无统计学意义(P>0.05)。因此,在 0~3 μmol/L间选择适当浓度,研究 As4O6 对 MCF-7 细胞迁移侵袭作用的影响。随 As4O6浓度增加(9、12、15 μmol/L),细胞凋亡率升高,与0 μmol/L 比较,细胞凋亡率差异

有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结果见图 2。

4.3 六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响

与 0 μmol/L 比较,低浓度(1 μmol/L)和高浓

度(3 μmol/L)As4O6对 MCF-7细胞的迁移能力均有

明显抑制作用(P<0.01),随 As4O6浓度增加,抑制作用明显增强,呈剂量依赖性,见图3。

4.4 六氧化四砷对乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡和周期相关基因表达的影响

琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡(Caspase-3、p21)和周期(Cyclin A2、Cyclin E1)相关基因表达情况。

结果表明,As4O6作用于MCF-7细胞24 h后,随 As4O6给药浓度增加,Cyclin E1、p21 mRNA表达呈升高趋势,Cyclin A2 mRNA表达呈递减趋势,呈剂量依赖性;在 As4O6高浓度(15 μmol/L)时,Caspase-3、p21、Cyclin A2、Cyclin E1 mRNA表达水平与0 μmol/L 比

较,差异均有统计学意义(P<0.01),见图4。

4.5 六氧化四砷对乳腺癌 MCF-7 细胞基质金属蛋白

酶-9基因表达的影响

MMP-9与侵袭转移相关,其mRNA表达随As4O6

浓度增加而逐渐降低。高浓度(15 μmol/L)As4O6与μmol/L 比较,MMP-9 mRNA表达差异有统计学意

义(P<0.01),见图 5。

讨论

研究表明,As4O6 可通过引起肿瘤细胞凋亡[4]、抑制肿瘤血管新生[5]、增加实体肿瘤对放射的敏感

性[6]等多种方式发挥抗肿瘤药效作用。但其对乳腺癌的作用机制尚不明确,而乳腺癌在全球女性癌症患病率排名居首,迫切需要有效的治疗药物。因此,研

s4O6治疗乳腺癌的作用机制十分必要。细胞凋亡和周期是衡量肿瘤细胞的重要指标,胞增殖和细胞凋亡之间的失衡也可导致肿瘤生成。研究结果表明,As 4O6对乳腺癌 MCF-7 细胞增殖抑制作用明显,并随 As4O6浓度增加而增强,当浓度达到

4 μmol/L 时,细胞存活率<50%。当浓度为9、12、

5 μmol/L 时,作用于 MCF-7 细胞 24 h可明显引起凋

亡。Caspase-3 和 p21 是与细胞凋亡关系密切的 2 种基因,正常情况下细胞质中 Caspase-3 无活性,以酶原形式存在,当细胞受到凋亡信号刺激时,它被一系

列反应激活后诱导细胞凋亡发生[7]。同时,p21 基因的过表达可促进细胞凋亡,并可使细胞周期阻滞于

1、G2 或 S 期。而本研究结果表明,随 As4O6浓度

增加,Caspase-3 和 p21 均呈增加趋势,且流式细胞

术检测结果表明,MCF-7细胞凋亡情况与上述特点相符,提示 As4O6可通过促进 MCF-7 细胞凋亡途径达到抑制肿瘤细胞增殖目的。为进一步明确 As4O6 对

MCF-7细胞的作用机制,本研究检测了细胞周期相关基因(Cyclin A2 和 Cyclin E1)的表达情况。Cyclin A2

为一种细胞周期的正向调节蛋白,可与细胞周期依赖

性激酶(CDK1 和 CDK2)形成复合物,在细胞周期

G1/S 和 G2/M转换中发挥调节DNA合成和促进细胞有丝分裂的双重作用,同时,Cyclin E1 是 G1 期重要的调控细胞周期的关键蛋白,促进细胞周期的 G1/S移行过程,并且是移行过程中的主要限速因子,一旦Cyclin E1 基因扩增或表达失控则可能诱发肿瘤[8-10]。

本研究结果表明,As4O6可抑制 Cyclin A2 基因的表达,经 As4O6干预后,MCF-7 细胞 Cyclin A2 表达显著降低,表明 As4O6可以通过干预细胞周期达到治疗目的。而 Cyclin E1 与 Cyclin A2 的结果相反,As4O6

干预后,MCF-7 细胞 Cyclin E1表达显著升高,这一现象可能与细胞周期阻滞相关。因此,更加明确了As4O6对 MCF-7细胞凋亡和周期相关基因的作用机制。

乳腺癌是由乳房组织病变导致的癌症,由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性,细胞之间的黏附能力下降,容易发生脱落,形成的游离癌细胞可随血液或

淋巴液散布周身,使乳腺癌发生侵袭转移。MMP-9是肿瘤细胞发生侵袭转移的主要参与者。由于Ⅳ型胶原是构成细胞外基质的基本骨架,而 MMP-9 分泌的

明胶酶可降解Ⅳ型胶原[11],因此 MMP-9 在肿瘤的侵袭及转移过程中起到关键作用。本研究结果表明,经

As4O6干预后,MCF-7 细胞 MMP-9 mRNA表达呈降低趋势,提示 As4O6可通过抑制 MMP-9 基因的表达有效抑制乳腺癌 MCF-7 细胞的侵袭能力。进一步结合划痕愈合实验结果,表明As4O6可有效抑制乳腺癌

MCF-7细胞的侵袭和迁移能力。

综上所述,As4O6 可通过干预细胞凋亡、细胞阻

滞、细胞侵袭及迁移能力等多途径发挥药效。As4O6可促进乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡,将其阻滞在 S 期,破坏肿瘤细胞 DNA 合成来抑制细胞增殖,其机制可能与 p21、Caspase-3、Cyclin E1、Cyclin A2有关。此

外,As4O6可通过抑制MMP-9分泌,阻止细胞基底膜降解,达到对MCF-7细胞侵袭转移能力的抑制作用。

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(收稿日期:2016-12-09)

(修回日期:2016-12-19;编辑:向宇雁)

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