辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

尹丽颖1,李凤金 1,仲丽丽 1,敖鹏 1,张妍妍 1,边晓燕 1,唐丹丽 2

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2.中国中医科学院,北京 100700

摘要:目的 探讨辽东楤木叶总皂苷(ETS)诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响。方法 MTT 法检测不同浓度(6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg)ETS 培养的结肠癌 HT-29 细胞增殖率,

Hoechst33258 染色和激光共聚焦成像检测细胞凋亡,并观察凋亡细胞的形态学改变,免疫组化检测凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 的表达。结果 ETS 可诱导 HT-29细胞发生凋亡,且凋亡作用在一定范围内呈剂量依赖性; ETS 可使 HT-29 细胞 Bcl-2 表达降低、Bax 表达升高(P<0.05,P<0.01),且呈明显的量效关系。结论 ETS可诱导 HT-29细胞凋亡,其凋亡机制可能与降低Bcl-2、升高 Bax的表达相关。

关键词:辽东楤木叶总皂苷;HT-29 细胞;细胞凋亡;Bcl-2;Bax

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.012

中图分类号:R285.5 文献标识码:A

文章编号:1005-5304(2017)06-0049-04

Effects of ETS on Apoptosis of Human Colorectal Cancer HT-29 Cells YIN Li-ying1, LI Feng-jin1, ZHONG Li-li1, AO Peng1, ZHANG Yan-yan1, BIAN Xiao-yan1, TANG Dan-li2 (1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2. China Academy of Chinese Medical Sciense, Beijing 100700, China)

Abstract: Objective To study the apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells induced by Aralia elata Seem leaf total saponin (ETS) and its effects on the expression of relevant proteins. Methods MTT assay was used to detect the proliferation of human colorectal cancer HT-29 cells cultivated with different concentrations (6.25, 12.5, 25,

50, 100, 200 mg/kg) of ETS. Hoechst33258 staining and laser confocal imaging were used to detect the apoptotic cells. Morphological changes were observed. The expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry. Results ETS could induce apoptosis of HT-29 cells and apoptosis was in a dose-dependent manner in a certain range. ETS could decrease the expression of Bcl-2 and increase the expression of Bax in HT-29 cells

(P<0.05, P<0.01), showing a significant dose-effect relationship. Conclusion ETS can induce the apoptosis of HT-29 cells, and the mechanism may be related to reducing the expression of Bcl-2 and increasing the expression of Bax.

Key words: Aralia elata Seem leaf total saponin; HT-29 cells; cell apoptosis; Bcl-2; Bax

随着我国人民生活水平的提高,全民的膳食结构发生了重大改变,结肠癌的发病率和死亡率也随之升

高[1]。目前除传统手术、放化疗等手段外,中医药治疗结肠癌越来越受到青睐。本课题组前期研究发现,辽东楤木叶总皂苷(total saponine of Aralia Elata Seem leaves,ETS)具有良好的抗肿瘤作用,且对人结肠癌

作用效果明显,但其作用机制尚不十分明确[2]。本实验采用 MTT 法检测人结肠癌 HT-29 细胞增殖率,通过 Hoechst33258 染色、激光共聚焦成像等方法检测细胞凋亡,观察ETS对凋亡细胞形态的影响,并用免疫

基金项目:黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划项目

(051226);黑龙江中医药大学科研基金项目(201218);哈尔滨

市科技局项目(404S223)通讯作者:唐丹丽,E-mail:tangdanli@hotmail.com 组化检测凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 的表达,探讨 ETS对 HT-29细胞凋亡的诱导作用及其可能的机制。

1 实验材料

1.1 药物和细胞株

ETS由黑龙江中医药大学药理教研室提供;人结肠癌 HT-29 细胞株由中国医学科学院基础医学研究所提供。

1.2 主要试剂与仪器

MTT(美国 Sigma 公司,批号 0793);hyclone

PRMI-1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司,批号 AAJ206662);胎牛血清(TBD,批号

OW20150122-0256);Hoechst33258 荧光染液(碧云天生物技术研究所,批号 20131105);抗 Bcl-2 抗体(Sant Cruz,批号14H80415);抗 Bax抗体(Sant Cruz,批号 14V70207);S-P Kit试剂盒(福州迈新试剂公司,

批号 SA1052)。激光共聚焦显微镜(德国 ZEISS 公

司),CO2培养箱(HF90/HF240 力新仪器上海有限公司),荧光显微镜(德国 Leica),电热恒温水浴锅

(DK-S24,上海森信实验仪器有限公司),低速离心

机(LDZ4-1.2,北京医用离心机厂),MILLI-Q 超纯净水纯化系统(北京同德创业科技有限公司)。

2 实验方法 2.1 细胞培养

常规培养 HT-29 细胞至 80%~90%融合时,PBS冲洗后加入含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶1 mL消化,低速离心。弃上清液,加入新鲜培养基,分装后于 5%CO2、37 ℃下培养备用。

2.2 细胞增殖检测

取对数生长期HT-29细胞,调整浓度至1×105/mL,接种于 96 孔板上,每孔 100 μL 悬液,每组6个复孔,

5%CO2、37 ℃孵育 24 h,随后依次加入不同浓度的ETS 加药培养基(6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg),

对照组加入等体积空白培养基。48 h后弃培养基,加入 MTT 溶液,5%CO2、37 ℃孵育4 h,加入 DMSO

溶液,37 ℃溶解 10 min,于酶标仪波长 570 nm处测

定吸光度(OD),计算细胞抑制率[(1-受试药组平均OD值÷对照组平均OD 值)×100%]。

2.3 细胞核染色

按“2.1”项方法培养细胞。于 6孔板中进行细胞爬片,培养24 h后给药组加入含不同浓度(10、20、

40 mg/kg)ETS 的 1640 培养基2 mL,对照组加入等体积 1640 培养基。培养48 h 后,弃培养液,PBS冲

洗,4%多聚甲醛 0.5 mL 固定 10 min,PBS 冲洗 2次,加入 Hoechst33258 染色液,5 min 后 PBS 冲洗 2 次,自然晾干,荧光显微镜观察并拍照。

2.4 细胞凋亡检测

按 “2.3”项下方法培养细胞。培养48 h后弃培养液,PBS 冲洗 2 次×2 min,加入 200 μL Binding Buffer,再加入 10 μL Annexin-V-FITC 和 5 μL PI,室温避光染色15 min,最后加入 300 μL Binding Buffer,激光扫描共聚焦显微镜检测。

2.5 Bcl-2、Bax 表达检测

按 “2.3”项下方法培养细胞。培养 48 h后弃培养液,PBS 冲洗 2 次×2 min,4%多聚甲醛固定,PBS冲洗 3 次×3 min,加入 PBS配制新鲜的 3%H2O2,室温孵育 10 min 灭活内源酶后,PBS冲洗 3 次×3 min,随后加入正常山羊血清封闭液,室温20 min。冲洗后加入抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体及抗GAPDH抗体(1∶ 200 稀释),4 ℃过夜,PBS冲洗后加入辣根过氧化物

酶标记二抗,37 ℃孵育 30 min,PBS 冲洗后DAB 显色,苏木素复染,脱水、透明、封片、镜检。高清晰图文分析系统对图像进行分析,以核膜或胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性区域,随机选取5 个 400倍视野计算阳性细胞率。

3 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,组间比较采用单因素方差分析。P<0.05 —

表示差异有统计学意义。

4 结果 4.1 辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌 HT-29 细胞增殖的影响

不同浓度 ETS 对 HT-29 细胞有不同程度的增殖

抑制作用,并呈剂量依赖性。50、100、200 mg/kg ETS

组较对照组差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。—

4.2 Hoechst33258 染色细胞核结果

与对照组细胞核均匀淡蓝色比较,经 ETS 处理后,HT-29细胞核呈亮蓝色浓染,说明细胞核染色质发生了固缩,致使细胞核与 Hoechst33258 的结合能力增强,且随浓度的增加,亮蓝染色的比例增加。结果见图1。

4.3 AnnexinV-FITC/PI 双染法细胞凋亡结果对照组细胞结构完整,呈不规则三角形,无染色或仅有微弱的绿色荧光。经ETS 干预 24 h后,各组均可见大量凋亡细胞,且随浓度的增加,凋亡细胞比例升高。早期凋亡的细胞仅在细胞膜处呈绿色荧光,细胞核不着色;中、晚期凋亡的细胞则细胞膜处呈现绿色荧光,细胞核处呈现红色荧光。结果见图2。

4.4 辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌 HT-29 细胞凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax 表达的影响

与对照组比较,各浓度ETS 组可见 Bcl-2 蛋白表达显著降低、Bax 蛋白表达显著升高(P<0.05,P< 0.01),见表 2。Bcl-2 形态学表现为胞膜及胞浆中棕黄色颗粒减少,见图 3;Bax 形态学表现为胞膜及胞浆中棕黄色颗粒增多,见图4。

5 讨论

中药辽东楤木具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效,可用于治疗神经衰弱、风湿性

关节炎、肝炎、糖尿病等肾气不足之证[3]。现代药理研究显示,ETS具有抑制癌细胞生长的作用[4],对人结肠癌 HT-29 细胞作用尤为显著[5]。但其是否与诱导细胞凋亡有关尚不明确,本研究通过检测凋亡相关指标进一步探讨其对人结肠癌HT-29 细胞的作用机制。

细胞凋亡异常与许多疾病尤其是癌症的发生发展有着密切关系。近年来,运用细胞凋亡手段研究中

药抗癌机制成为热点[6-7]。Hoechst33258 染色是通过对细胞核染色质进行染色对细胞核的形态进行观察。本实验结果显示,经ETS干预的细胞出现不同程度致密浓染颗粒且在一定范围内与浓度呈正相关,表明ETS具有诱导人结肠癌 HT-29 细胞凋亡的作用。

AnnexinV-FITC/PI 双染法是区分凋亡早期及中晚期细胞的有效方法。本实验结果显示,不同浓度ETS 对 HT-29细胞均可产生诱导凋亡的作用,且随浓度的增加中晚期凋亡细胞增加。

肿瘤的发生、发展与细胞的过度增殖、正常凋亡受到抑制两个因素相关。因此,研究凋亡相关蛋白的表达成为研究抗肿瘤药物作用机制的重要途径之

一[8]。Bcl-2 是目前发现最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因,而 Bax 作为 Bcl-2 家族的一员,具有 Bcl 促细胞凋亡功能,Bax 和 Bcl-2 通过形成同源或异源二聚

体来调节细胞凋亡[9]。本研究发现,不同浓度ETS 能影响 HT-29 细胞 Bcl-2 和 Bax 的表达,其中 Bcl-2 蛋白表达显著下降,而Bax蛋白表达显著上升。

综上,本研究结果表明,ETS具有诱导人结肠癌

HT-29细胞产生凋亡的作用,其机制可能与其调节凋亡蛋白 Bax 和 Bcl-2 的表达相关。

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(收稿日期:2016-06-21)

(修回日期:2016-07-29;编辑:华强)

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