针刺对血管性痴呆大鼠前额叶皮层氧化应激及神经元损伤的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

杜斯琪,王雪蕊,朱雯,姬彩硕,李天然,肖凌勇,刘存志

首都医科大学附属北京中医医院,针灸神经调控北京市重点实验室,北京 100010

摘要:目的 观察针刺对慢性脑低灌注大鼠前额叶皮层氧化应激及神经元损伤的影响,探讨针刺改善血管性痴呆(VD)大鼠认知损害的分子机制。方法 采用永久性双侧颈动脉结扎法造成大鼠慢性脑低灌注复制VD模型,造模后大鼠随机分为模型组、针刺组和非穴组,同时设假手术组作为对照。针刺组和非穴组造模后3d

针刺治疗,2周后灌注取材。尼氏染色检测前额叶皮层神经元数量,DHE染色检测活性氧(ROS)含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 模型组神经元数量、SOD 活性较假手术组降低,ROS含量升高;针刺组神经元数量和SOD活性较模型组明显升高、ROS含量降低,同时非穴组各指标未见明显改善。结论 针刺可抑制VD大鼠前额叶皮层的氧化应激水平,改善神经元损伤和丢失。关键词:针刺;血管性痴呆;氧化应激;神经元损伤;活性氧;超氧化物歧化酶;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.013

中图分类号:R245 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0053-03

Effects of Acupuncture on Oxidative Stress and Neuronal Damage in Prefrontal Cortex of Vascular Dementia Rats

DU Si-qi, WANG Xue-rui, ZHU Wen, JI Cai-shuo, LI Tian-ran, XIAO Ling-yong, LIU Cun-zhi (Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University, Beijing Key Laboratory of Acupuncture Neuromodulation, Beijing 100010, China)

Abstract: Objective To observe the effects of acupuncture on oxidative stress and neuronal damage in the prefrontal cortex of chronic cerebral hypoperfusion (CCH) rats; To investigate the molecular mechanisms of acupuncture in cognitive impairment of vascular dementia (VD) rats. Methods The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion (2VO) to induce CCH in rats. After modeling, rats were randomized into model group, acupuncture group and non-acupoint group. Sham-operation group was set as control group. Rats of acupuncture group and non-acupoint group were treated with needling for 2 weeks at 3 days after 2VO. Nissl and DHE staining were respectively used to evaluate the numbers of neurons and ROS level. SOD activity was examined by xanthine oxidase technique. Results Compared with sham-operation group, the number of neurons and SOD activity decreased in the model group, while the ROS level increased. Compared with the model group, the number of neurons and SOD activity increased in the acupuncture group, while the ROS level decreased. There were no obvious changes in all indexes in non-acupoint group. Conclusion Acupuncture can inhibit oxidative stress and improve neuronal damage and loss in the prefrontal cortex of VD rats.

Key words: acupuncture; vascular dementia; oxidative stress; neuronal damage; SOD; ROS; rats

血管性痴呆(VD)是常见呆病,表现为脑血流减少,认知功能进行性下降。临床上对VD尚无明确

的诊断和治疗标准[1]。有研究显示,永久性双侧颈动

脉结扎(2VO)造成的大鼠慢性脑低灌注是最常用的VD 模型[2]。造模后皮层神经元损伤和丢失、白质损

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81473501)

通讯作者:刘存志,E-mail:lcz623780@126.com

伤等病理改变均与认知功能损害密切相关[3]。本课题组前期研究表明,针刺能明显改善 VD 大鼠学习记

忆[4-5]。本研究采用 2VO模型,观察针刺对VD 大鼠前额叶皮层氧化应激水平的影响,探讨其相关机制。1 材料与方法

1.1 动物

10周龄SPF级雄性大鼠48只,体质量300~320 g,北京市维通利华技术有限公司,动物许可证号SCXK

(京)2012-0001。饲养于中国中医科学院基础理论研究所 SPF级动物实验室。

1.2主要试剂与仪器

焦油紫染色液(上海碧云天生物技术公司),活性氧(ROS)试剂盒(美国 GENMED 公司),超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。冰冻切片机(德国 Leica 公司),DHG-9023A 烤箱(上海林频仪器有限公司),光学显微镜(日本 Olympus),一次性无菌针灸针(华佗牌,0.25 mm×13 mm)。

1.3造模与分组

采用 2VO 大鼠复制 VD 模型[6],另随机取 12 只大鼠作为假手术组,假手术组手术过程与造模一致,但双侧颈总动脉不结扎。造模成功大鼠随机分为模型组、针刺组和非穴组,每组12 只。

1.4 干预

针刺组和非穴组于造模后3 d针刺治疗,其中针刺组选取“百会”和双侧“足三里”捻转补法各30 s,

后不留针,取穴位置参照文献[7],非穴组参照文

[8-9]取常用非穴点(双胁肋下髂棘直上 10 mm)行行针手法的浅刺不留针。以上治疗每日1次,连续

6 d 休息1d,共 12次。另外假手术组、模型组和非穴组进行与针刺组相同时间和手法的捉抓刺激。

1.5取材及处理

末次针刺后第 2 日,大鼠腹腔注射 2.5%戊巴比

妥钠(0.2 mL/100 g)麻醉,每组取5只大鼠4%多聚甲醛固定,并取出全脑,蔗糖梯度脱水后冰冻切片(厚度 10 μm);剩余大鼠直接断头后分离前额叶皮层,

-80 ℃冰箱保存。

1.6 神经元损伤检测

将切片置于50 ℃焦油紫染色液中孵育45 min,用蒸馏水冲洗除去浮色,再用乙醇梯度脱水、二甲苯透明,最后用中性树脂及盖玻片封片,镜下观察皮层神经元改变。

1.7活性氧含量测定

室温下将切片滴加DHE试剂避光孵育30 min,封片后用荧光显微镜观察,其中激发波长为540 nm,发射波长为 590 nm。

1.8超氧化物歧化酶活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法测定,按照 SOD 试剂盒说明书操作,用分光光度仪测定。

1.9统计学方法

采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示,采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学—

意义。

2结果

2.1针刺对大鼠前额叶皮层神经元的影响

与假手术组比较,模型组皮层神经元数量显著减少,且细胞形态固缩或不规则;针刺组神经元数量增加(P<0.05),且形态固缩的神经元减少;而非穴组与模型组比较无明显差异。结果见图1、图 2。

2.2针刺对大鼠前额叶皮层活性氧含量的影响

镜下 DHE 染色的目的荧光呈红色,假手术组未见明显阳性染色。模型组较假手术组 ROS 含量明显

升高(P<0.05),针刺组较模型组 ROS含量明显降低

(P<0.05)。结果见图 3、图 4。

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05(下同)图 2 各组大鼠前额叶皮层神经元数量比较(x±s,每组— 5 只)

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