红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

黄平,蒋锦杏,徐璇,陈丽

深圳市人民医院,广东 深圳 518020

摘要:目的 观察红景天苷对胶质瘤 U87-MG 细胞增殖和侵袭能力的影响,探讨其诱导 U87-MG 细胞凋亡机制。方法 不同浓度红景天苷和喜树碱加入U87-MG 细胞中,作用24 h 后,MTT法测定 U87-MG 细胞增殖,流式细胞术检测U87-MG 细胞凋亡率,Transwell 法检测 U87-MG细胞侵袭能力,间接荧光标记法测定细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot 检测 U87-MG 细胞 Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin 和

基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果 与空白对照组比较,各给药组U87-MG细胞生长抑制作用明显,

10、50、100 —g/mL 红景天苷作用 U87-MG 细胞后,细胞侵袭能力显著下降,10、50、100 —g/mL 红景天苷作用 U87-MG 细胞 48 h后均能诱导 U87-MG 细胞凋亡;ROS水平与红景天苷浓度呈正相关;10、50、100 —g/mL红景天苷上调 Caspase-3、Bax 和 E-cadherin 的表达,下调 Bcl-2 和 N-cadherin 和 MMP-9 的表达。结论 红景天苷可诱导 U87-MG 细胞凋亡、抑制 U87-MG细胞的侵袭能力。

关键词:红景天苷;胶质瘤U87-MG 细胞;细胞增殖;活性氧;Caspase-3;基质金属蛋白酶-9

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.016

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0064-04

Effects of Salidroside on Proliferation and Invasive Ability of Glioma U87-MG Cells

HUANG Ping, JIANG Jin-xing, XU Xuan, CHEN Li (Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, China)

Abstract: Objective To investigate the effects of salidroside on proliferation and invasive ability of glioma

U87-MG cells; To discuss the its mechanism to induce apoptosis of U87-MG cells. Methods U87-MG cells were cultured in vitro for 24 h under different concentrations of salidroside and camptothecin. The proliferation of U87-MG cells was detected by MTT assay. The apoptosis rate of U87-MG cells was detected by flow cytometry. Transwell assay was used to detect the invasive ability of U87-MG cells. ROS was detected by indirect fluorescent labeling. The expressions of Caspase-3, Bcl-2, Bax, E-cadherin, N-cadherin and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in U87-MG cells were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group, U87-MG cells had significant inhibitory effect on the growth of U87-MG cells in each administration group, and the invasive ability of U87-MG cells was significantly reduced after 10, 50, 100 μg/mL salidroside was intervened, and 10, 50, 100 μg/mL salidroside for 48 h for U87-MG cells could induce apoptosis of the cells; the level of ROS was positively correlated with the concentration of salidroside; 10, 50, 100 μg/mL salidroside up-regulated the expressions of Caspase-3, Bax and E-cadherin, and down-regulated the expressions of Bcl-2, N-cadherin and MMP-9. Conclusion Salidroside can induce apoptosis of

U87-MG cells and inhibit the invasive ability of U87-MG cells.

Key words: salidroside; glioma U87-MG cells; proliferation; ROS; Caspase-3; MMP-9

脑胶质瘤在临床上多呈恶性,其容易局部扩散,

治疗比较困难且易复发,大多数患者预后不良[1]。近年来,随着医学的进步及学科间的不同领域交叉融合,特别是转化医学理念的不断深入,胶质瘤治疗手段取得极大的进步,逐渐形成了一套比较完整的治疗

体系[2-3]。临床上普遍采用以手术切除为基础,结合放疗、化疗、免疫、分子靶向等综合治疗策略,这其中包括临床常用的化疗药物替莫唑胺,但其存在一定的毒副作用和耐药性,所以,在低毒性的前提下提高 化疗药物的药效显得尤为重要。

红景天苷(salidroside)提取自红景天全草或根茎,是红景天的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性[4-6]。但目前尚未见文献对红景天苷的抗胶质瘤机制进行探讨。因此,本实验以红景天苷为活性物质,通过体外和细胞实验初步观察红景天苷对胶质瘤系 U87-MG 细胞增殖和侵袭能力的影响,并探讨红景天苷抗血管生成信号通路的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

正常脑细胞和脑胶质瘤细胞系U87-MG,基尔顿生物科技(上海)有限公司,本实验室进行培养。

1.2 药物及制备

红景天苷、喜树碱(20 mg,分析标准品),阿拉丁试剂(上海)有限公司,药物用pH 6.8 PBS 配制浓度为 1000 —g/mL 药液。

1.3 主要试剂与仪器

Caspase-GlooR3 试剂盒、非放射性 NF-κB EMSA试剂盒,Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司;MTT,上海生工生物工程有限公司;小牛血清,杭州四季青

生物试剂公司;胰蛋白酶、RPMI-1640 培养基,美国GIBCO 公司;FITC/PI 双染试剂盒,碧云天生物试剂

公司。酸度计(上海雷磁仪器厂),CO2 培养箱(美国 REVCO公司),流式细胞仪(美国 BectonDikinson公司),酶联免疫检测仪(芬兰 Labsystems 公司),酶联检测仪(美国 Bio-Rad 公司)。

1.4 U87-MG 细胞增殖检测

取200 —L/孔对数生长期U87-MG细胞(1×105/孔)接种于 96孔板中,进行培养。培养24 h后,分别加入红景天苷和喜树碱(10、50、100 —g/mL)培养基,设空白对照组,每个药物3个平行孔。分别培养24 h,每孔加5 mg/mL MTT 试剂 20 —L,继续培养4h。将培养基吸出,加150 —L DMSO试剂,充分振荡后,充分溶解结晶,于570 nm处测定各孔吸光度(OD),计算细胞活力。细胞活力(%)=实验组 OD 值÷空白对照组OD 值×100%。

1.5 U87-MG 细胞侵袭能力测定

Transwell 小室滤膜内表面涂细胞外基质胶,小室干燥后重新加入含有 0.1%胎牛血清的细胞培养基水

化。4.0×105/mL 重悬浮细胞在 Transwell 小室下室中加入新鲜10%胎牛血清培养基,上室中加入红景天苷

和喜树碱(10、50、100 —g/mL)培养基,设定空白对照组,每个药物设3个平行孔,培养24 h,每孔中加 100 —L细胞悬浮液。常规细胞培养24 h。取出小室后,PBS 溶液冲洗滤膜,PBS棉棒吸除和擦除上室的细胞,再根据 Transwell 小室使用说明进行染色观察,计算穿膜细胞数,从而反映各组细胞的侵袭能力。实验重复3次。

1.6 U87-MG 细胞凋亡检测

将对数生长期 U87-MG 细胞以 1×105/孔接种于96孔板中,置于恒温恒湿培养箱培养。培养24 h 后,分别加入 0、10、50、100 μg/mL 红景天苷培养基, 培养 48 h后,收集细胞 PBS重新悬浮细胞,先加5 —L FITC-Annexin V避光染色5 min,再加 10 —L PI 避光染色 15 min,室温避光孵育 15 min。流式细胞仪检测。

1.7 U87-MG 细胞活性氧检测

U87-MG细胞接种后,恒温、恒湿培养24 h 后,

分别加入红景天苷(10、50、100 —g/mL)的培养基,设 3个平行组。加入400 —L DCFH-DA 10 —g/mL,充分混匀后,避光孵育15 min。PBS 冲洗去除细胞外荧光剂。PBS重悬细胞 10 min后对荧光强度进行检测。1.8 U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、

N-cadherin 和基质金属蛋白酶-9表达检测

收集对数生长期 U87-MG 细胞进行相应的空白对照组和红景天苷组处理24 h,进行各组细胞总蛋白的提取,通过 Bradford 方法调整相同的蛋白浓度后进行电泳,获得根据分子量分离的蛋白条带,按照Western blot显像试剂盒指导说明进行,蛋白NC膜电转,进行蛋白封闭和一抗结合,一抗结合后洗脱,再行二抗孵育标记兔抗大鼠的多克隆抗体。ECL试剂盒显色后,暗室发光拍照,以GAPDH为内参进行分析。

1.9 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。实验结果以x±s表示,多组间比较采用方差分析和两样本q检验。—

P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷对U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

与空白对照组比较,各给药组细胞活力和侵袭能力下降(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性。结果见表1、图 1。

2.2 红景天苷对 U87-MG 细胞凋亡的影响

随红景天苷组浓度的增加(10、50、100 —g/mL),

U87-MG细胞凋亡率不断增加,且呈剂量依赖性,当红景天苷浓度增加到 100 —g/mL 时,细胞凋亡率为

(58.40±2.33)%,诱导 U87-MG细胞凋亡的作用增强。结果见图2。

2.3 红景天苷对 U87-MG 细胞活性氧水平的影响

与空白对照组比较,细胞内 ROS 水平随喜树碱浓度的增加变化不明显,而随红景天苷浓度的增加而增加,当红景天苷浓度增加至 100 µg/mL 时 ROS 水平最高(P<0.05,P<0.01)。结果见表 2。

Caspase-3 和 Bax 的表达呈不断增加的趋势,Bcl-2 的表达呈不断减少的趋势,差异均有统计学意义(P<

0.05,P<0.01)。结果见表 3、图 3。

3讨论

信号通路的下放与肿瘤的发生、转移息息相关,众多癌症预后不良反应均与肿瘤喜好通路有关,同时

肿瘤组织也会通过内源性因子的调控促进肿瘤细胞的生长。因此,阻截信号通路下放已成为肿瘤靶向治疗的重要手段之一。凋亡是由多种基因严格调控的过程,如 Caspase 和 Bcl-2 家族等。Caspase-3 是各凋亡

[7]

通路的靶蛋白 ,凋亡途径被激活后,引起相应的Caspase 蛋白表达的改变,最终将激活 Caspase-3 诱导细胞凋亡的发生。本实验结果显示,红景天苷能参与并影响 Caspase-3 级联凋亡途径反应的诱导凋亡通路的表达。线粒体信号途径是线粒体上游信号分子作用

于线粒体膜,Bcl-2 蛋白活化形成蛋白通道,线粒体PT孔开放,凋亡活性物质释放引起下游 Caspase-3 蛋

白活化并作用于相应底物引起细胞凋亡。Bcl-2 是Caspase 的上游信号,其中 Bax 是促凋亡蛋白,Bcl-2是抗凋亡蛋白。本实验结果显示,红景天苷参与并下调 Bcl-2 的表达,增强 Bax 的表达,使 Bcl-2/Bax比值降低。因此,细胞凋亡可能通过线粒体途径实

现的,这与张艳等[8]研究阿魏酸对人胃癌 MGC-803细胞增殖的 Caspase-3、Bax 和 Bcl-2 的表达影响趋势一致。

MMP-9 作为MMP家族中的一员,能通过降解层黏连蛋白和Ⅳ、Ⅴ型胶原等成分来对肿瘤细胞基底膜

成分造成破坏,因此,MMP-9 在细胞侵袭中发挥关键作用。N-cadherin 通过降低肿瘤细胞间的黏附性,诱导细胞迁移和侵袭率增加,而 E-cadherin 的下调会影响肿瘤细胞间的连接稳定性,促使肿瘤细胞侵袭的

发生[9]。本实验结果发现,红景天苷能诱导 E-cadherin表达的增加,N-cadherin 和 MMP-9 表达的降低。因此,红景天苷既可通过抑制 MMP-9 和 N-cadherin 的表达,破坏细胞间和基底膜黏附性的能力,又可通过上调 E-cadherin 的表达,增加肿瘤细胞间的稳定性,进一步抑制 U87-MG细胞的迁移和侵袭能力。

本研究考察了不同浓度红景天苷对细胞内 ROS的影响,发现红景天苷可以诱导细胞内 ROS 水平的上升,而 ROS 是由细胞内氧代谢或外源性氧化剂产生的具有生物活性的氧分子,其在启动和调节细胞凋

亡中具有着重要的作用[10-12]。本实验中未发现喜树碱 引起细胞内 ROS 水平的上升,表明红景天苷可促进ROS 诱导 U87-MG 细胞的凋亡。

参考文献:

[1] 戴宜武,王振光,秦家振.脑胶质瘤治疗进展[J].中华临床医师杂志,

2013,7(7):6225-6228.

[2] GROOT M,DOUW L,SIZOO E M,et al. Levetiracetam improves verbal memory in high-grade glioma patients[J]. Neuro-oncology,2013,

15(2):216-223.

[3] MANNAS J P, LIGHTNER D D, DEFRATES S R, et al. Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma[J]. J Clin Neurosci,2014,

21(1):121-123.

[4] 祁存芳,张军峰,陈新林,等.红景天苷通过抑制凋亡相关蛋白的表达

保护缺氧对培养神经干细胞的损伤[J].南方医科大学学报,2013,33(7):

962-966.

[5] 陈刚,黄晓军,吕伯东,等.红景天苷对低氧环境下大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞α-肌动蛋白和骨桥蛋白表达的影响[J].中华男科学杂志,

2013,19(8):727-731.

[6] HAN T. Effects of salidroside pretreatment on expression of tumor necrosis factor-alpha and permeability of blood brain barrier in rat model of focal cerebralischemia-reperfusion injury[J]. Asian Pac J Trop Med,2013,6(2):156-158.

[7] 孔亚,王佳佳,卢宗亮,等.桔梗皂苷 D 诱导乳腺癌 MDA-MB-231 细胞凋

亡[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2016,23(3):261-265.

[8] 张艳,李海龙,王虎平,等.阿魏酸对人胃癌 MGC-803 细胞增殖的影

响[J].中国中医药信息杂志,2016,23(9):70-73.

[9] 常琳琳,朱虹,郑琳,等.E-cadherin 在肿瘤治疗中的研究进展[J].药

学进展,2015,39(10):754-760.

[10] 刘仪,王凯,王介非.氧化应激诱导细胞凋亡的机制[J].中华临床感

染病杂志,2008,1(3):123-126.

[11] 刘小敏,王晓娟,张杨,等.活性氧改变在 PIG11 高表达诱导人肝癌

HepG-2 细胞凋亡中的作用[J].肿瘤,2009,29(12):1116-1119.

[12] SEPÚLVEDA M, GONANO L A, BACK T G, et al. Role of CaMKⅡ and ROS in rapid pacing-induced apoptosis[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology,2013,63(2):135-145.

(收稿日期:2016-08-17)

(修回日期:2016-09-18;编辑:华强)

Newspapers in Chinese (Simplified)

Newspapers from China

© PressReader. All rights reserved.