氨水提取联合陶瓷膜超滤技术纯化甘草苷工艺研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

朱应怀 1,2,刘晓霞 1,王继龙 1,魏舒畅 1,3,金辉 1

1.甘肃中医药大学药学院,甘肃 兰州 730000;2.甘肃中医药大学附属医院药学部,甘肃 兰州 730000;

3.甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室,甘肃 兰州 730000

摘要:目的 建立一种适合于工业化生产的甘草苷提取纯化工艺路线。方法 以甘草苷的提取率为指标,采用正交试验确定最佳提取条件;并以甘草苷的保留率和除杂率为指标,通过正交试验优选最佳超滤工艺参数。结果 最佳提取条件为 0.75%氨水 24倍,提取3次,每次 60 min,甘草苷平均提取率为 72.3%。最佳超滤工

艺参数:10 nm无机陶瓷膜,压力 0.12 MPa,温度 25 ℃,甘草苷平均保留率为98.9%,平均除杂率为 23.3%。结论 该工艺生产成本低,安全性好,适合工业化应用。

关键词:甘草苷;超滤;保留率;除杂率

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.018

中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0071-04

Study on Purification of Liquiritin by Using Ammonia Extraction and Ceramic Membrane

Ultrafiltration Technology ZHU Ying-huai1,2, LIU Xiao-xia1, WANG Ji-long1, WEI Shu-chang1,3, JIN Hui1 (1. College of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Department of Pharmacy, the Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

Abstract: Objective To establish a suitable extraction and purification process line for industrial production of liquiritin. Methods With the extraction rate of liquiritin as index, orthogonal test was used to determine the optimum conditions; with the retention rate of liquiritin and impurity removal rate as the indexes, orthogonal test was used to optimize the best ultrafiltration process parameters. Results The optimum extraction conditions were: 24 times 0.75% ammonia water, extracted three times, each time under 60 min. The liquiritin average extraction rate was 72.3%. The best ultrafiltration process parameters were: 10 nm inorganic ceramic membrane, pressure of 0.12 MPa, temperature of 25 ℃. The liquiritin average retention rate was 98.9%, and the average removal rate of impurity was 23.3%. Conclusion This process has low production cost and good safety, and is suitable for industrial application.

Key words: liquiritin; ultrafiltration; retention rate; impurity rate

甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草 G.inflata Bata.或光果甘草 G.glabra L.的干燥根及根茎,现已作为药食两用品种,具有补脾益气、

祛痰止咳、清热解毒、调和诸药等功效[1]。对甘草活性组分的深入研究表明,甘草苷不仅具有保护心肌细

胞膜、保护神经、抗抑郁等药理活性[2-4];而且以甘草苷为主的甘草总黄酮作为优良的天然抗氧化剂,对油脂的效果明显优于丁基羟基茴香醚(BHA)和2,6

二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)等,可用于各类含油食

基金项目:国家自然科学基金(81060345、81460608);甘肃省

基础研究创新群体项目(1506RJIA034)

通讯作者:魏舒畅,E-mail:wsch006@163.com 品,并在美白祛斑方面效果显著,可大量应用于化妆品行业。

鉴于甘草苷属于二氢黄酮类成分且具有弱酸性的特点,本研究首次将无机陶瓷膜超滤技术与氨水提取工艺联合应用于甘草苷的提取和纯化,通过正交试验确定一条适合于工业化生产的甘草苷提取纯化工艺路线,旨在为获取高品质的甘草苷提供技术支持。

1 仪器与试药

SJM 陶瓷超滤设备超滤膜(10、20、50 nm),合

肥世杰膜工程有限公司;Agilent-1206 型液相色谱仪(包括 Agilent Chemstation 色谱工作站,Agilgent1206系列二元泵,Alltech ELSD•2000 型蒸发光散射检测器),美国 Agilgent 公司;ZORBAX SB-C18 分

析柱(4.6 mm×250 mm,5 µm),杭州赛析科技有限

公司;ABT100-5M 电子天平,德国 KERN 公司;

DZF-6090 型真空干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公

司;AKRY-UP-1816 型超纯水机,成都唐氏康宁科技发展有限公司。

甘草购于兰州市黄河药材市场,经甘肃中医药大学药学院魏舒畅教授鉴定为 Glycyrrhiza uralensis

Fish.的干燥根及根茎。甘草苷对照品(纯度≥93.1%,批号 111610-201106),中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1甘草苷含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取甘草苷对照品适量,精密称定,加70%乙醇制成每 1 mL含甘草苷 21 µg的对照品溶液,备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取甘草粉末(过3号筛)约 0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加 70%乙醇

100 mL,密塞,超声处理(功率250 W,频率 40 Hz)

30 min,放冷,转移并定容至 100 mL 容量瓶,0.45 µm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.1.3 甘草提取样品液的制备 精密吸取甘草样品

1 mL,置具塞锥形瓶中,加70%乙醇 100 mL,密,超声处理(功率250 W,频率 40 Hz)30 min,冷,摇匀,转移并定容至 100 mL容量瓶,经 0.45 µm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.1.4 色谱条件与系统适用性试验 参照2015年版

[1]《中华人民共和国药典》(一部) ,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相A为乙腈,B为 0.05%磷酸溶液,梯度洗脱(见表1);检测波长 237 nm,柱温 25 ℃,进样量 20 µL。理论板数按甘草苷峰计算应不低于 5000。

2.1.5 线性关系与范围 分别精密吸取 1、2.5、5、

10、15、20 µL甘草苷对照品溶液,注入高效液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标,进样量(µg)为横坐标,作回归曲线,得回归方程 Y=3039.6X+1.223 1,

r2=0.999 9,线性范围为 0.021~0.42 µg。

2.1.6 甘草样品液含量测定 将“2.1.3”项下样品

液按“2.1.4”项下条件测定,代入回归方程计算。

2.2提取工艺研究

2.2.1 提取溶剂的选择 根据生产实际的需要,分

别选取水、3%氨水溶液为提取溶剂,以甘草苷提取率及提取液的出膏率为评价指标进行考察。甘草苷提取率(%)=(提取样品液中甘草苷含量÷供试品溶

液中甘草苷含量)×100%。出膏率(%)=(提取物

质量÷药材质量)×100%。提取方法:称取甘草饮片 100 g,加入溶剂 900 mL,回流提取 2 次,每次

1.5 h,合并提取液,浓缩至 500 mL。按“2.1.6”项下方法测定甘草苷含量并计算,结果见表 2。可见,

3%氨水提取液的甘草苷提取率高于水提液,且出膏率低,考虑后续分离、精制的成本,最终选取 3%氨水溶液为提取溶剂。

2.2.2 溶剂浓度的筛选 按“2.2.1”项下提取方法,考察氨水浓度分别为 0.3%、0.5%、0.75%、1%、2%、

3%时对甘草苷提取率的影响,结果见图1。可见,当氨水浓度为0.75%时,甘草苷提取率达到最高,之后随着氨水浓度的增大,提取率不再增加,从节约生产成本和提高提取效果出发,选取0.75%氨水溶液为提取溶剂。 2.2.3 提取工艺正交试验 以甘草苷提取率为指标,选取氨水用量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为考察因素,采用 L9(34)正交设计优选甘草苷最佳提取条件。因素水平见表 3,正交试验结果见表4,方差分析见表5。

由直观分析和方差分析结果可知,影响甘草苷提取率的各因素重要次序为氨水用量(A)>提取时间(B)>提取次数(C),且因素 A、B、C 对甘草苷提取率均有显著影响。优化的提取条件为A3B2C3,即

0.75%氨水 24倍,回流提取3次,每次 60 min。

2.2.4 提取工艺验证试验 称取 3 批甘草饮片,各

300 g,按筛选的最佳工艺 A3B2C3平行提取3次,测得甘草苷提取率分别为 72.4%、71.7%、72.9%,平均提取率为72.3%,RSD<3%,说明该工艺稳定可行。

2.3 超滤工艺研究

2.3.1 提取液的制备 按上述最佳提取工艺,分别称取甘草饮片 1.6 kg制备甘草苷提取液,放置过夜后取上清液,剩余药液经3000 r/min 离心 15 min,收集上清液,将2次上清液合并,备用。

2.3.2 超滤工艺正交试验 根据本课题组的前期研

究[5-6],以甘草苷保留率、除杂率为评价指标,采用

L9(34)正交设计对超滤膜孔径(A)、操作压力(B)、料液温度(C)进行优化,因素水平见表 6,正交试验结果见表7,方差分析结果分别见表8、表 9。除杂率(%)=(未超滤样品出膏率-超滤样品出膏率)÷

未超滤样品出膏率×100%。保留率(%)=超滤透过

液中甘草苷含量÷未超滤液中甘草苷含量×100%。

由直观分析可知,影响指标的因素重要次序分别为甘草苷保留率 B>A>C、除杂率 A>B>C;较好的因素水平组合分别为甘草苷保留率A3B2C1、除杂率A1B2C3。通过方差分析可知,因素 B对甘草苷保留率和除杂率均有显著影响,则选取第2水平较好;而因

素A只对除杂率有显著影响,则选取第1水平较好;因素C对两者均无显著影响,但从节约成本和实际操作的便利考虑,选择第1水平较好。综合分析,最终选取 A1B2C1为最佳超滤工艺,即 10 nm无机陶瓷膜在压力 0.12 MPa和料液温度25 ℃条件下进行超滤。

2.3.3 超滤工艺验证试验 分别称取同一批甘草饮片各 3.2 kg,共 3 批,按“2.3.1”项下操作后,按最佳超滤工艺 A1B2C1 进行验证,甘草苷保留率分别为

98.6%、98.9%、99.1%,除杂率分别为 22.9%、23.3%、

23.7%,甘草苷平均保留率为 98.9%,超滤过程平均除杂率为 23.3%,均 RSD<3%,说明该工艺稳定可操作。

3 讨论

本研究选用0.75%氨水提取甘草苷时,其提取效

果与文献报道的乙醇提取效果[7-9]相近,但提取成本远低于乙醇提取。由于以氨水为提取溶剂可溶解的大分子杂质多,会造成甘草苷的后续纯化、精制困难,所得产品纯度较低。针对上述缺点,本研究将超滤技术与氨水提取工艺联用,在保留甘草苷的同时,有效除去了氨水提取出的大分子杂质,可保证甘草苷提取物纯度。

由于中药提取液中大分子亲水物质及无机离子等易产生死吸附,对超滤膜造成不可逆的污染,制约了超滤技术在中药产业化的应用。文献报道,甘草有

效成分的超滤纯化多选用有机超滤膜[10-12],但有机膜除热稳定性差、机械强度低、易变形等缺点外,在纯化中药提取液的过程中易形成永久性污染,使用寿命短,导致在工业化应用时成本极高。为解决工业生产适用性问题,本研究采用的无机陶瓷超滤膜机械强度高、化学稳定性好,在高速错流条件下用苛性化学清洗剂冲洗可解决膜污染问题,有效地延长了膜使用寿命。

由于膜组件在临界压力以下过滤时可有效防止膜表面不可逆污染的形成,因此,本试验依据课题组

前期的研究基础[5-6],在工艺优化设计过程中,将滤过压力的最大取值设在临界压力以下,保证所优化出 的超滤工艺其工作压力低于临界通量压力,该工艺在工业生产时,可有效延长膜的清洗周期和使用寿命。

本研究以氨水为提取溶剂,可同时得到甘草苷和甘草酸,并通过超滤技术除去了大部分大分子杂质,使料液黏度大幅度降低,为后续采用固体膜萃取技术[13]进一步分离甘草酸和甘草苷奠定了基础。

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(收稿日期:2016-08-13)

(修回日期:2016-10-10;编辑:陈静)

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