桂枝配方颗粒、饮片、水煎剂HPLC指纹图谱相关性研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:河北省高等学校科学技术研究项目(ZD2015001) 通讯作者:牛丽颖,E-mail:niuliyingyy@163.com

王晓亚1,甄亚钦 2,3,王鑫国 2,3,姜国志 3,4,牛丽颖 1,2,3

1.河北医科大学,河北 石家庄 050017;2.河北中医学院,河北 石家庄 050091;

3.河北省中药配方颗粒工程技术研究中心,河北 石家庄 050091;4.神威药业集团有限公司,河北 石家庄 051430摘要:目的 采用 HPLC 对桂枝配方颗粒、饮片和水煎剂的指纹图谱进行相关性研究,考察三者之间化学成分的差异。方法 采用 Diamonsil C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 µm),流动相为乙腈-0.1%磷酸,梯度洗脱,检测波长280 nm,流速 1.0 mL/min,柱温 30 ℃。分别建立10 批桂枝配方颗粒、10批饮片、10批水煎剂的指纹图谱。结果 桂枝配方颗粒 HPLC 指纹图谱中的 12 个共有峰均可在水煎剂中得到追踪,有 10 个可在饮片中得到追踪,并指认出原儿茶酸、香豆素、肉桂酸3种成分。结论 桂枝配方颗粒与水煎剂的主要化学成分组成基本相同,其共有成分含量比例接近。关键词:桂枝配方颗粒;饮片;水煎剂;高效液相色谱法;指纹图谱;相关性;肉桂酸

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.022

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0087-04

Correlation of HPLC Fingerprint Chromatograms of Cinnamomi Ramulus Formula

Granules, Decoction Pieces and Water Decoction WANG Xiao-ya1, ZHEN Ya-qin2,3, WANG Xin-guo2,3, JIANG Guo-zhi3,4, NIU Li-ying1,2,3 (1. Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2. Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China; 3. Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology Research Center, Shijiazhuang 050091, China; 4. Shineway Pharmaceutical Group Ltd., Shijiazhuang 051430, China)

Abstract: Objective To study the correlation of fingerprint chromatograms of Cinnamomi Ramulus formula granules, decoction pieces and water decoction by HPLC; To investigate the difference of main chemical constituents among different forms. Methods The Diamonsil C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) was used with mobile phase of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 mL/min, with detection wave of 280 nm and temperature of 30 ℃. The detection of 10 batches of Cinnamomi Ramulus formula granules, 10 batches of decoction pieces and 10 batches of water decoction were established respectively. Results Totally 12 peaks in the HPLC fingerprint chromatogram from 10 batches of formula granules could be tracked in the water decoction; 10 peaks in the HPLC fingerprint chromatogram could be tracked in the decoction pieces. Three components, such as protocatechuic acid, coumarin and cinnamic acid were verified. Conclusion The main chemical components of Cinnamomi Ramulus formula granules and water decoction are basically the same, and the common component contents have similar proportion.

Key words: Cinnamomi Ramulus formula granules; decoction pieces; water decoction; HPLC; fingerprint chromatogram; correlation; cinnamic acid

桂枝为樟科植物肉桂 Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝,具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气的功效,用于治疗风寒感冒、脘腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛、痰饮、水肿、心悸、奔豚[1]。桂枝主要含有挥发油类、有机酸类、多糖类、甾体类、香豆素类及鞣质类等成分,具有抗菌、抗炎、抗病毒、解热、镇

静、镇痛、抗惊厥、抗肿瘤、利尿等药理作用[2-4]。肉桂酸和原儿茶酸属于有机酸类成分,肉桂酸具有抗菌、升高白细胞、利胆、抗突变、诱导人肺癌细胞恶性表型逆转和抗侵袭等药理作用,原儿茶酸是抗炎、

抗菌的活性成分[5]。桂枝配方颗粒是以符合炮制规范的桂枝饮片作为原料,经提取、浓缩、喷雾干燥、制粒等现代化制备工艺加工而成,解决了传统汤剂制备和使用不方便的问题,具有免煎易服、起效快、携带方便、安全卫

生等优点。中药配方颗粒经一系列制备工艺加工制成后,在性状和显微鉴别上已完全不同于原饮片,无法以此评价其质量,因此,对中药配方颗粒制定有效可行、重复性好的质量控制方法意义重大[6-7]。本研究采用 HPLC方法分别建立了桂枝配方颗粒、饮片和水煎剂的指纹图谱,并比较三者主要化学成分的差异,旨在为桂枝配方颗粒替代传统饮片的可行性研究及其质量控制和评价提供依据。

1 仪器与试药

日本岛津 LC-15C 高效液相色谱仪(LC-15C 泵,

SPD-15C 型紫外检测器,SIL-10AF 自动进样器,

CTO-15C 柱温箱,岛津LC色谱工作站),日本岛津; Diamonsil C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 µm),北京迪马; TB-215D 电子天平(十万分之一)、

BSA224S-CW 电子天平(万分之一),德国赛多利斯。原儿茶酸对照品(批号 151123,纯度≥98.0%),成都普菲德生物技术有限公司;香豆素对照品(批号

TM0520CA14,纯度≥98.0%),上海源叶生物科技有限公司;肉桂酸对照品(批号 110786-200503,纯度

100.0%),中国食品药品检定研究院;10 批桂枝饮片分别来自广东(编号Y1~Y4)、广西(编号Y5~Y10),经河北省药品检验院主任中药师孙宝惠老师鉴定为樟科植物肉桂 Cinnamomum cassia Presl 的干燥嫩枝;

10 批桂枝水煎剂(编号 S1~S10),严格按照《医疗机构中药煎药室管理规范》药材煎煮方法相关要求制

备;桂枝配方颗粒,由神威药业集团有限公司(7 批中试小样,编号 K1 ~ K7 ; 3 批中试成品,批号

15051411、15061411、15052711)及其他 5个中药配方颗粒试点生产企业(批号 1509001S、1507005、

5070291、15018592、1507009)提供;乙腈为色谱纯,水为纯化水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 µm);

流动相:乙腈(B)-0.1%磷酸(A),梯度洗脱(0~

25 min,10%→20%B;25~48 min,20%→35%B;48~

58 min,35%B;58~60 min,35%→90% B;60~68 min,

90%B);检测波长:280 nm;流速:1.0 mL/min;柱

温:30 ℃;进样量:10 µL。

2.2 对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸对照品、香豆素对照品、肉桂酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含原儿茶酸 10 µg、香豆素 20 µg、肉桂酸 23 µg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取 10批桂枝配方颗粒适量,研细,取约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率 35 kHz)

20 min,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,即得桂枝配方颗粒供试品溶液;取 10批桂枝饮片,粉碎,过4号筛,各取约 0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,照配方颗粒制备方法制备得桂枝饮片供试品溶液;称取粉碎后的 10 批桂枝饮片各10 g,加水,浸泡30 min,煎煮,保持微沸30 min,倒出煎液,药渣再分别加水煎煮2次,时间分别为30、

20 min,合并 3次煎液,过滤,真空减压浓缩,浓缩液真空干燥,得干浸膏,研细,取约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,照配方颗粒制备方法制备得桂枝水煎剂供试品溶液。

2.4 方法学考察

选择峰 11作为参照峰,计算12个主要特征峰的相对保留时间(RRT)、相对峰面积(RPA)的 RSD值。以桂枝配方颗粒(批号 15051411)进行方法学考察。

2.4.1 精密度试验 按“2.3”项下方法制备桂枝配方颗粒供试品溶液,连续进样6次,考察仪器的精密度。结果各主要特征峰RRT的RSD为0.02%~0.11%, RPA的RSD为0.34%~1.98%,表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 按“2.3”项下方法制备桂枝配方颗粒供试品溶液,分别于制备后0、4、8、12、18、

24 h 进样 10 µL,考察供试品溶液的稳定性。结果各主要特征峰 RRT 的 RSD 为 0.01%~0.19%,RPA 的RSD为0.51%~1.99%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 按“2.3”项下方法制备 6 份桂枝配方颗粒供试品溶液,进样测定。结果各主要特征峰 RRT 的 RSD 为 0.01%~0.09%,RPA 的 RSD 为

0.47%~1.97%,表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立与相关性分析

2.5.1 桂枝配方颗粒、饮片、水煎剂指纹图谱的建立 按“2.3”项下方法分别制备 10 批桂枝配方颗粒(神威药业集团有限公司提供)、饮片、水煎剂的

供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录

64 min色谱图,将所得到的色谱数据导入《中药指纹

图谱相似度评价系统(2012 版)》软件,采用多点校正将谱峰自动匹配,平均数法计算得出样品指纹图谱的共有模式,结果见图1~图3。其中,确定了 10 批桂枝配方颗粒 12 个共有峰,并指认了峰 1 为原儿茶酸、峰9为香豆素、峰11为肉桂酸,见图4。

2.5.2 指纹图谱相关性分析 采用《中药指纹图谱

相似度评价系统(2012版)》计算相似度,10批桂枝配方颗粒、饮片、水煎剂指纹图谱的相似度见表 1。

10批桂枝配方颗粒指纹图谱的相似度均在0.99以上,说明桂枝配方颗粒的相似度很高,产品制剂工艺稳

定;10批桂枝饮片指纹图谱的相似度均在0.86 以上;

10 批桂枝水煎剂指纹图谱的相似度均在 0.98 以上,说明 10 批桂枝水煎剂有良好的相似性。比较桂枝配方颗粒、饮片、水煎剂的指纹图谱,对共有峰进行分析可知,桂枝配方颗粒 12 个特征峰在水煎剂中均能得到追踪,而桂枝饮片 6、12 号峰缺失,其他 10 个峰均存在,说明桂枝配方颗粒与水煎剂化学成分基本一致,桂枝饮片经高温提取、浓缩等工艺处理后可能产生了新的成分,见图5。

2.6 不同厂家桂枝配方颗粒指纹图谱的建立

分别取市售6个厂家桂枝配方颗粒适量,研细,取不同量的配方颗粒使之均相当于 3.6 g 饮片,精密

称定,按“2.3”项下方法制备供试品溶液(取样量见表2),分别进样 10 µL,采集 6个不同厂家桂枝配方颗粒指纹图谱,采用《中药指纹图谱相似度评价系统

2012版)》计算相似度,结果见图6、表 3。

3讨论

中药配方颗粒在制备过程中有效成分已被煮提出来,因此制备供试品溶液时采用超声溶解即可。本试验对提取溶剂的种类和提取时间进行了考察。分别

50%、70%、100%甲醇作为提取溶剂,结果表明,

50%甲醇作为提取溶剂时色谱峰数量较多、强度较,故选用 50%甲醇作为提取溶剂;选择 10、20、

30 min进行提取时间考察,结果超声20、30 min 比超声 10 min 效果好,超声20 min 与 30 min差别不大,故采用 20 min 为提取时间。

试验中采用 DAD 检测器对桂枝配方颗粒供试品溶液进行了紫外全波长扫描,结果显示,肉桂酸在

280 nm处呈现最大吸收,且谱图中出现的色谱峰数目较多,峰形和分离度良好,基线平稳,故采用280 nm作为检测波长。

在共有峰研究中,以峰面积及响应值最大的11 号 峰即肉桂酸峰为S峰。将桂皮醛对照品进样对照,发现桂枝饮片中含有大量桂皮醛,但桂枝配方颗粒和水煎剂中未能检测到。桂皮醛属于挥发油类成分,可能在高温提取、浓缩、干燥等制备过程中损失了。

试验中比较了 10 批桂枝饮片的指纹图谱,结果相似度偏低,说明不同批次饮片主要化学成分含量比例差别较大,可能与原药材的产地和采收时间等因素有关。

本试验将市售不同厂家的桂枝配方颗粒的HPLC指纹图谱进行比较,发现6个不同厂家桂枝配方颗粒指纹图谱的相似度均在0.99 以上,说明6个厂家生产的桂枝配方颗粒主要化学成分基本相同,其共有成分含量比例接近。

本试验采用HPLC对桂枝配方颗粒进行指纹图谱研究,方法学考察中精密度、稳定性、重复性的RRT和 RPA 均 RSD<2.0%,说明该方法稳定可行、重复性良好,能较全面地反映桂枝配方颗粒的内在质量,为桂枝配方颗粒的质量控制和评价提供参考。

桂枝配方颗粒、饮片、水煎剂指纹图谱的主要色谱峰基本一致,尤其配方颗粒与水煎剂指纹图谱的相似度高达 0.98以上,说明桂枝配方颗粒与水煎剂主要化学成分基本等同,为桂枝配方颗粒替代传统饮片的可行性研究提供了参考。

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(收稿日期:2016-10-18)

(修回日期:2016-11-08;编辑:陈静)

B t/min注:A.混合对照品;B.桂枝配方颗粒供试品; 1.原儿茶酸;9.香豆素;11.肉桂酸批桂枝配方颗粒中原儿茶酸、香豆素、肉桂酸HPLC 图

图 5 t/min 注:A.饮片;B.配方颗粒;C.水煎剂10批桂枝饮片、配方颗粒、水煎剂对照指纹图谱匹配图

图 2 10批桂枝饮片 HPLC指纹图谱 t/min

图 1 10批桂枝配方颗粒HPLC指纹图谱 t/min

图 3 10批桂枝水煎剂HPLC指纹图谱 t/min

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