加味丹参饮对大鼠心肌缺血再灌注损伤SSAT活性的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Bcl-2 -

任婷 1,2,饶春梅 2,成细华 1,杨胜辉 1,孙彦波 2,陈聪 3,彭霞 2,黄政德 3

1.湖南中医药大学医学院,湖南 长沙 410208;

2.湖南中医药大学研究生院,湖南 长沙 410208;3.湖南中医药大学中医学院,湖南 长沙 410208摘要:目的 观察加味丹参饮对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤(IRI)模型精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT)/多胺通路的影响,探讨其抗IRI 的机制。方法 结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min 再灌注 90 min 建立大鼠心肌 IRI模型。实验大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和加味丹参饮组,每组10 只。TTC染色测定大鼠心肌梗死面积,ELISA检测大鼠心肌组织SSAT 含量,RT-PCR 和 Western blot分别检测大鼠心肌组织SSAT mRNA和蛋白表达,HPLC检测大鼠心肌组织多胺(腐胺、精脒、精胺)含量。结果 与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死面积、SSAT 含量增加,SSAT mRNA 和蛋白表达升高,多胺含量降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,加味丹参饮组大鼠心肌梗死面积、SSAT含量减少,SSAT mRNA和蛋白表达降低,多胺含量升高(P<0.05,P<0.01)。结论 加味丹参饮可能通过调节SSAT/多胺通路,增加心肌细胞多胺含量,从而对大鼠心肌IRI发挥保护作用。关键词:加味丹参饮;心肌缺血再灌注损伤;多胺;精脒/精胺乙酰转移酶;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.015

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)07-0062-04

Effects of Modified Danshen Decoction on SSAT Activity of Rats with Myocardial

Ischemia/Reperfusion Injury REN Ting1,2, RAO Chun-mei2, CHENG Xi-hua1, YANG Sheng-hui1, SUN Yan-bo2, CHEN Cong3, PENG Xia2, HUANG Zheng-de3 (1. Medical School, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Graduate School, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 3. Chinese Medicine School, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

Abstract: Objective To observe the effects of modified Danshen Decoction on spermidine/spermine acetyltransferase (SSAT) /polyamine pathways of SD rats with IRI; To investigate its protective mechanism. Methods The model of IRI was established by ligating left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 90 min. The SD rats were randomly divided into the control group, sham-operation group, model group and modified Danshen Decoction group, with 10 rats in each group. The myocardial infarction size was measured by using TTC staining. The contents of SSAT were measured by ELISA. The SSAT mRNA and SSAT protein expression level were detected with real-time fluorescent quantitative PCR method and Western blot, respectively. The contents of polyamines (putrescine, spermidine, spermine) in cardiac tissue were detected by HPLC. Results Compared with sham-operation group, the myocardial infarction size, the SSAT content, the SSAT mRNA and SSAT protein expression levels of model group increased significantly, the contents of polyamines decreased significantly, with statistical significance (P<0.01); Compared with model group, the myocardial infarction size of modified Danshen Decoction group was significantly reduced, while the SSAT content and SSAT mRNA and protein expression level decreased significantly, the contents of polyamines increased, with statistical significance (P<0.05, P<0.01). Conclusion Modified Danshen Decoction can adjust the SSAT polyamine pathways and increase polyamine content in cardiomyocytes, and thus play a role of protection of myocardial ischemia-reperfusion injury.

Key words: modified Danshen Decoction; myocardial ischemia/reperfusion injury; polyamines; spermidine/ spermine acetyltransferase; rats

近年来,随着血运重建技术的广泛开展,心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)机制及心肌保护的研究成为倍受重视的课题,但IRI 所涉及机制复杂,目前尚未清楚,临床上仍缺乏针对心肌保护的药物。多胺(腐胺、精脒和精胺)是存在于真核细胞且含高密度正电荷的一类有机小分子,广泛参与胚胎发育、细胞生长与分化、细胞程序性凋亡及

基因表达调控等重要的生理病理过程[1]。研究发现,多胺系统在 IRI 发挥重要作用[2]。在 IRI 时,多胺代谢失衡,多胺分解代谢的限速酶——精脒/精胺乙酰转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)

表达改变,腐胺生成增多而精胺、精脒减少[3-4],均与 IRI密切相关。本课题组前期研究发现,益气活血中药复方加味丹参饮对防治心肌IRI 有重要作用[5-7]。本研究在此基础上,采用 SD 大鼠制作 IRI 模型,观察加味丹参饮预处理对大鼠 IRI 后 SSAT 表达和活性及多胺含量变化的影响,从SSAT/多胺分解代谢调控角度进一步探讨该方抗心肌IRI机制,为防治心肌IRI寻找新的靶点和药物。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级SD 大鼠 100 只,雌雄各半,8~10周龄,体质量 220~300 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号 SYXK(湘)2013-0005。饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心,温度18~25 ℃、湿度50%~60%,正常光照,自由摄食饮水。

1.2 药物

加味丹参饮(丹参20 g、檀香 6 g、赤芍 10 g、川芎6g、当归 6g、红花 6 g、生地黄 12 g 等),饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房,药物混匀,浸泡 30 min,水煎 2次(檀香后下),合并煎液,过滤,浓缩至1g 原药材/mL。

1.3 主要试剂与仪器

腐胺、精脒、精胺(美国 Sigma 公司),ELISA试剂盒(Clod-Clone Corp 公司),RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas 公司), Trizol 试剂(Invitrogen 公司),反转录试剂盒(Taka-Ra公司),SYBR GreenPCR Master Mix(美国 ABI),引物(上海生工生物工程技术服务有限公司),BCA蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司),兔抗大鼠 SAT1 一抗(Bioss 公司),β-actin 一抗(Santa cruz 公司),HRP 耦联山羊抗兔 IgG(美国 Sigma 公司)。小动物呼吸机(浙江大学医学实验仪器厂,DH-8型),十六导生理记录仪(Biopac 公司,MPl50 型), RT-PCR 仪(美国 ABI 公司,7900 型),水平电泳槽(北京君意东方仪器公司,JY-SPC),电泳仪(北京鼎国生物技术发展中心,DG-Ⅲ),紫外凝胶检测和成像系统(BIO-RAD,美国),高速冷冻离心机(美国Sigma 公司)。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[3]方法进行造模。大鼠腹腔注射 10%

水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉,切开气管,连接小动物呼吸机行人工通气,于第 3、4 肋间开胸暴露心脏,于冠状动脉左心室前降支离左心耳下缘约0.15 cm处绕左心室支穿线结扎,缺血30 min后剪开结扎线,再灌注 90 min,造成心肌IRI。假手术组冠状动脉穿线不结扎。术中连续监视心电图Ⅱ导联的变化,以ST段抬高,T波高耸、倒置或左心室变为苍白色为心肌缺血结扎成功(心肌缺血)的标志,剪开结扎线后ST段回落50%以上、高耸 T波下降或左心室由苍白变为暗红色表示再灌注成功。

2.2 分组与给药

实验大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和加味丹参饮组,每组 10 只。加味丹参饮组每日

[8]

给予加味丹参饮 7.74 g/kg 灌胃 (按人和动物间体表面积等效剂量换算),于末次灌胃1 h后建立IRI模型。正常对照组、假手术组和模型组均予等量生理盐水灌胃。灌胃体积均为 7.74 mL/kg,每日 2次,连续 14 d。

2.3 指标检测

2.3.1 TTC 染色测定心肌组织梗死面积 再灌注结束后取下心脏,剪除左心室以外心肌组织,置于

-20 ℃冰箱冰冻10 min后切片,每片厚约1 mm,放入1%TTC PBS(pH 7.4)中,37 ℃水浴箱中孵育20 min,振荡染色液,使之与心肌充分接触。终止染色后将切片置于10%甲醛溶液中固定过夜。数码相机拍照,存活心肌呈砖红色,梗死区呈灰白色。应用 Imagemaster VDS 图像分析仪分析心肌梗死面积占心肌总面积的百分比。心肌梗死面积率(%)=所有切片梗死面积

之和÷心肌总面积之和×100%。

2.3.2 ELISA 检测心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶含量 再灌注结束后取大鼠左心室肌组织,用预冷PBS冲洗后加入5 mL PBS,于玻璃匀浆器冰上充分研磨,匀浆液 5000 r/min 离心 5 min,取上清液,按 ELISA试剂盒说明书测定SSAT 含量。

2.3.3 RT-PCR 检测心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶mRNA 表达 再灌注结束后取大鼠左心室组织,参照Trizol 试剂盒方法提取总RNA,取 2 μL RNA稀释后,

在紫外分光光度仪上测定样品 RNA 纯度及浓度。以总 RNA 为模板,按反转录试剂盒合成 cDNA,取上述所得 cDNA 按 25 μL 体系,RT-PCR 仪进行扩增。PCR 扩增条件为:95 ℃预变性5 min,95 ℃ 10 s,

60 ℃ 1 min,循环 40次。反应结束后读取Ct 值,通过融解曲线监测各样本PCR反应的特异性,以 β-actin为内参基因,采用 2-ΔΔCt 法进行数据分析,ΔCt= Ct 目的基因-Ct 内参基因,ΔΔCt=ΔCt 给药组-ΔCt 对照组,差

别倍数=2-ΔΔCt,其中正常对照组数值设为 1。PCR 引物序列SSAT正义5'-AAAGGCACTGTCTTGCCACT-3',反义 5'-GTGGCTGGACGGATCTTAAA-3',产物长度

231 bp;β-actin正义5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3',反义 5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3',产物长度

228 bp。

2.3.4 Western blot检测心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶蛋白表达 取大鼠左心室心肌组织,加入预冷全细胞裂解液,于液氮内研磨,将匀浆冰上处理30 min,

4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min,提取胞浆总蛋白, BCA法测定上清液蛋白含量,置于-80 ℃备用。取胞浆蛋白,加入上样缓冲液,于100 ℃水中煮5 min,每孔 40 μg蛋白上样,经 10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离,电转至 PVDF 膜,取膜后置于含 5%脱脂奶粉封闭液中封闭1h,加 SSAT 或 β-actin 一抗(按 1∶500

稀释于一抗稀释液中),4 ℃孵育过夜;TBST洗膜后加 HRP标记羊抗兔 IgG 室温孵育1 h;TBST 洗膜后显色,凝胶成像系统拍照,计算条带吸光度值。SSAT蛋白表达以其与 β-actin 内参蛋白吸光度比值表示。

2.3.5 HPLC测定心肌组织多胺含量 参照文献[9]方法。再灌注后取左心室组织约150 mg,加 0.3 mmol/L

冷高氯酸,冰水浴中制成匀浆,3500 r/min 离心10 min,取上清液 400 μL,加入内标(1,6-己二胺)10 nmol混匀,加2 mol/L NaOH 2 mL、苯甲酰氯 10 μL,振荡 5 min,40 ℃水浴 30 min 后,加氯仿2 mL,振荡

2 min,2000 r/min 离心 10 min,取 1.5 mL氯仿层,加 2 mL流动相,振荡,离心,再吸取氯仿层,加热挥干,残余物溶于300 μL甲醇,取10 μL,HPLC 分析多胺。固定相为 Hypersil ODS C18 柱(250 mm×

4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-双蒸水(V∶V,65∶

35),柱温 35 ℃,流速 0.4 mL/min,紫外检测波长

229 nm,AUFS 0.04。

3 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,组间比较采用方差分析,方差不齐采用非—

参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 加味丹参饮对模型大鼠缺血再灌注心肌梗死面积的影响

与正常对照组比较,模型组大鼠心肌梗死面积率

显著增加(P<0.01);与模型组比较,加味丹参饮组

大鼠心肌梗死面积率显著降低(P<0.01)。结果见表1。—

4.2 加味丹参饮对模型大鼠心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶含量的影响

与正常对照组比较,假手术组大鼠心肌组织SSAT 含量无明显变化,模型组大鼠心肌组织 SSAT含量显著增加(P<0.01);与模型组比较,加味丹参饮组大鼠心肌组织 SSAT 含量显著降低(P<0.01)。结果见表2。

4.3 加味丹参饮对模型大鼠心肌组织精脒/精胺乙酰转移酶表达的影响

与正常对照组比较,假手术组大鼠心肌组织SSAT mRNA和蛋白表达无明显差异,模型组大鼠心肌组织 SSAT mRNA 和蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,加味丹参饮组SSAT mRNA表达显著降低(P<0.01)。结果见表 3、图 1。

5 讨论

多胺具有众多生理功能,并在许多病理过程中发挥作用,多胺能抑制内毒素诱导小鼠血清中炎症介质的释放;在心肌缺血和心肌肥大的细胞凋亡中均发挥重要作用。目前已知肿瘤发生、应激、心肌肥大、心肌重构、脑缺血等许多病理事件的发生与细胞内多胺代谢失衡有关,心肌IRI时多胺代谢失衡,鸟氨酸脱羧酶及 SSAT 的活性改变[10]。SSAT 为多胺代谢限速酶,SSAT 催化精胺逆转化为精脒及精脒逆转化为腐胺的过程。SSAT使腐胺生成增多而精胺、精脒减少,将导致继发性的心肌损伤。SSAT 过表达老鼠表现出多胺降解增加,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和

CYP450 表达下降,导致过氧化氢生成增加[11],可见影响 SSAT活性则可影响多胺含量变化,从而对心肌组织 IRI 产生影响。调控 SSAT 表达可能对于 IRI 具有潜在的治疗价值。

本实验结果发现,缺血再灌注时SSAT 含量显著增加,SSAT mRNA和蛋白表达均显著升高。同时发现 SSAT表达升高后,腐胺含量增加和精脒、精胺、总多胺池含量减少,表明心肌组织IRI 可能诱导多胺代谢过程产生应激反应,多胺分解代谢酶SSAT 表达升高。SSAT 腐胺生成增多而精胺、精脒减少,将导

致继发性的心肌损伤[12]。我们前期实验结果显示,加味丹参饮对IRI 心肌

有明显的延迟保护作用[5-7]。本研究结果显示,加味丹参饮预处理大鼠心肌IRI 模型后,SSAT mRNA 和蛋白表达均显著降低,SSAT 含量显著减少,提示加味丹参饮可能通过调节SSAT/多胺分解代谢,减少IRI后腐胺生成,从而发挥抗IRI保护作用,但具体机制尚待进一步研究。

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(收稿日期:2016-09-29)

(修回日期:2016-10-31;编辑:华强)

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