柴胡分子生药学研究进展

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Bcl-2 -

韩晓伟,严玉平,吴兰芳,杨加虎,郑玉光

河北中医学院,河北 石家庄 050200摘要:分子生药学是一门新兴的以生药为研究对象的交叉学科,其发展为传统的生药学研究提供了新的理论方法和技术,使对生药的研究达到了基因水平。柴胡作为传统中药,在传统研究方法基础上,也开展了分子生药学研究,并取得了一定成果。本文综述了近年来采用分子生药学手段的柴胡相关研究,并对该领域进行了展望,以期为进一步推动柴胡资源及其他中药资源的保护、开发和利用提供参考。关键词:分子生药学;基因;柴胡;分子生物技术;中药资源

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.032

中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)07-0125-04

Research Progress in Molecular Pharmacognosy of Bupleuri Radix HAN Xiao-wei, YAN Yu-ping, WU Lan-fang, YANG Jia-hu, ZHENG Yu-guang (Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China)

Abstract: Molecular pharmacognosy is an emerging interdisciplinary subject with crude drugs as research subjects. Its development provides a new theoretical method and technique for traditional pharmacognosy research, so that the study of crude drugs has reached the level of gene. As traditional Chinese materia medica, Bupleuri Radix has developed molecular pharmacognosy research on the basis of traditional research methods, and achieved certain results. This article summarized the research achievements of Bupleuri Radix through molecular pharmacognosy method in recent years, and prospected this field, in order to further provide references for the protection, development and utilization of Bupleuri Radix resources and other TCM resources.

Key words: molecular pharmacognosy; gene; Bupleuri Radix; molecular biological technology; TCM resources

分子生药学是生药学和分子生物学相互融合形成的一门新兴的交叉学科,由黄璐琦院士在 1995 年

首次提出[1]。分子生药学的提出,使生药学研究有了新的理论方法和技术,使我国生药学研究又迈上了一个新的台阶。经过 20 多年的发展,分子生药学在中药分子标识鉴定、中药资源保护和利用、中药优质高产方面都取得了很好的成果,使生药学研究不再停留于药用植物组织器官的层面,而是扩展到基因的层

面,为后基因组时代研究中草药奠定了基础[2]。

基金项目:河北省中医药管理局科研计划(2015081);河北中医

学院博士科研基金(BSZ2015003);河北省高等学校科学技术

研究项目(QN2015073);河北省现代农业技术体系中药材产业

创新团队建设(2017年);河北中医学院中药学重点学科建设

项目(7002016012019)

通讯作者:郑玉光,E-mail:zyg314@163.com

柴胡是我国常用的大宗中药材之一,历代本草典籍对其药性都有明确记载。柴胡性味苦寒,入肝胆经,具和解表里、疏肝、升阳之功效,主要用于感冒发热,寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等病证的治疗。2015 年版《中华人民共和国药典》[3]中规定的正品柴胡为伞形科植物柴胡 Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡 B. scorzonerifolium Willd.的干燥根,前者习称“北柴胡”,后者习称“南柴胡”。在分子生药学发展的 20 多年里,关于柴胡的分子生药学方面的研究也在持续进行。本文对近年柴胡分子生药学方面的研究进行了总结,以期为在分子水平对柴胡进行更深层次的研究提供参考。

1 柴胡生药鉴定的分子标记研究

生药鉴定是生药学的重要组成部分,生药鉴定的主要任务是研究生药的来源、品种鉴定、质量评价等。我国生药的品种繁多、来源复杂,在一定程度上制约

了中药的安全应用。柴胡作为我国常用的大宗中药材,具有来源复杂、品种丰富等特点[4],而利用传统的理化鉴别和性状鉴别的方法不能准确鉴别柴胡药材的来源和种属,因此,利用分子标记技术研究柴胡的种属鉴别逐渐成为研究热点。

分子标记技术以 1974 年 Grozdicker 首创 RFLP (限制性片段长度多态性)为开端,到 2003 年 Paul Hebert 提出DNA条形码技术,短短30年的时间里各国的科学家提出了十几种分子标记技术,其中常用的有 RFLP、RAPD(随机扩增多态性 DNA)、SSR(简单重复序列)、AFLP(扩增片段长度多态性)、ISSR (简单重复序列区间)和DNA barcoding(DNA 条形码)等。

1.1 RAPD 技术

RAPD是第二代分子标记技术,该技术在植物中的应用比较广泛,但其不足之处是稳定性相对较差,不同的物种需要使用不同的反应条件,即使同一物种的同一引物在实验条件改变时产生的谱带也会发生改变。AFLP 技术与 RAPD技术相似,其特点也是可

以简单快速的鉴定植物,但其稳定性也不佳。2002

年,梁之桃等[5]对柴胡属的物种植物进行了RAPD 分析和分类鉴别,这是对柴胡进行RAPD研究的开始。

[6]

2003 年,王秀全等 对柴胡种源的道地性进行了RAPD分析,发现利用RAPD可以准确的鉴定柴胡的道地性。随着对柴胡研究的深入,全国柴胡的主产区都开展了柴胡品种的RAPD 鉴定[7-10],同时,对 RAPD

的技术进行了一些优化[11],使其更适合柴胡的分析。在资源鉴定的基础上,对柴胡的干根药材、愈伤组织、试管植株等进行了RAPD 分析[12-14]。

1.2 SSR 和 ISSR 技术

SSR又称为微卫星DNA 或短串联重复,ISSR 是在 SSR的基础上发展起来的一种分子标记技术。SSR和 ISSR 可揭示更高的多态性,而且快速、简便,因

此在中药材鉴定中得到了广泛应用。2008 年,隋春

等[15]首次以北柴胡为材料进行了 ISSR 分析,这为利用 ISSR 技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助育种

以及遗传多样性研究奠定了基础。2010 年,战晴晴

等[16]利用 SSR 和 ISSR 技术构建了北柴胡的遗传图

谱,使对柴胡的研究进一步深入。2013 年,杨旻等[17]利用综合评分法对柴胡的ISSR-PCR 反应体系进行了

优化。2015 年,马艳芝等[18]对不同柴胡种质资源的ISSR 和 ITS进行了序列分析,认为将ISSR 和 ITS(转录间隔区)技术相结合可提高柴胡种质资源鉴定的准确性。随着SSR 和 ISSR技术的不断完善,利用该技

术鉴定柴胡的研究不断深入。赵香妍等[19]对北京地区野生的柴胡种质资源进行了 ISSR 研究,确定了百花山山腰及山脚的柴胡适宜推广种植,为柴胡栽培品种

的选育提供了新选择。吴素瑞等[20]对柴胡的栽培品种进行了 SSR的分子标记鉴别。通过长期反复的实验摸索,采用 SSR 和 ISSR技术成为鉴别柴胡种质资源的有效方法。

1.3 DNA 条形码

DNA条形码的鉴定是分子鉴定的最新发展方向,它是通过比较物种中的一段标准的 DNA 片段,对物

种进行快速、准确的识别和鉴定[21]。适于植物的条形码包括 psbA-TrnH、rbcL、rpoC1、rpoB、matK、ITS、

ITS2 等。2004 年,Neves S S 等[22]首次基于柴胡属植物的 ITS 序列对其进行了聚类分析。2005 年,武莹

等[23]对 5 种习用柴胡进行了 ITS 的序列鉴别。2006

年,谢晖等[24]对 9种柴胡属植物的核糖体ITS 序列进行了扩增和应用。近5年来,柴胡的鉴定主要以 ITS和 ITS2 扩增为主要方法[25-29],这为柴胡种质资源鉴定以及药材市场柴胡的真伪鉴别提供了快速简便的方法。

在ITS扩增的研究基础上,刘力等[30]进行了DNA芯片研究,涉及 18 种柴胡 DNA 芯片,发现基于 18种柴胡的 ITS 序列的差别所设计的 DNA 芯片可以将其区分开,这为柴胡的鉴定提供了新的方法。

2 柴胡有效成分生物合成分子机理与调控研究

传统中药材的有效成分绝大多数为次生代谢产物,合成路径复杂,其反应过程往往需要十几个甚至几十个酶的催化,因此,找到形成特定产物的关键酶就成为对药材进行合成的分子机理与调控研究的关键步骤,从而进一步利用基因工程技术生产药用植物的有效成分。柴胡皂苷的结构均为五环三萜类齐墩果

烷型衍生物,20 世纪 90年代,人们对萜类的生物合成途径进行了研究,根据 Ruzika 原则提出了萜类生

物合成的中心途径。在此基础上,董乐萌等[31]开始对合成皂苷途径的关键酶的基因片段进行了克隆和序列分析,为进一步克隆全序列及了解调控柴胡皂苷的

生物合成奠定了基础。2010-2015 年,北柴胡鲨烯合

酶基因[32]、IPPI 基因[33]、UGT 基因[34]、北柴胡细胞

[35]

色素 P450 基因 、北柴胡糖基转移酶基因

BcUGT1[36]、BcUGT3 和 BcUGT6[37]、BcUGT8[38]、与 P450 相关基因 cyp716y1[39]等与北柴胡皂苷合成相关基因相继被克隆和分析,同时还进行了一些遗传转

化方面的初步研究[40]。此类研究为揭示柴胡皂苷合成途径的分子机理奠定了基础。

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