一指禅推拿对坐骨神经损伤大鼠神经形态及功能的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

卢新刚1,喻立炜 1,苟海昕 1,陈敬贤 2,吴烨琳 1,盛晖 1,王佳禄 1,朱鼎成 1

1.复旦大学附属华东医院,上海 200040;2.上海交通大学附属瑞金医院,上海 200025摘要:目的 观察一指禅推拿对坐骨神经损伤大鼠神经形态及功能的影响。方法 暴露坐骨神经,用显微持针器钳夹坐骨神经制作坐骨神经损伤模型。SD 大鼠随机分为假手术组、模型组和推拿组,假手术组暴露神经但不夹持。造模7 d后,推拿组大鼠一指禅推法治疗30 d,每日 1 次。30 d后,检测大鼠坐骨神经功能指数(SFI)、右下肢运动功能指数(BBB),HE染色、免疫组化检测和电镜观察大鼠患侧坐骨神经变化。结果 与模型组比较,推拿组可有效加快 SFI 恢复,升高 BBB,促进坐骨神经形态结构恢复,S-100β 蛋白含量升高,促进新生神经超微结构生长及恢复。结论 一指禅推拿可有效促进大鼠坐骨神经损伤后神经形态及功能恢复。

关键词:一指禅推拿;坐骨神经损伤;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.009

中图分类号:R247.4-03 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)09-0035-04

Effects of One Finger Massage on Nerve Morphology and Function of Sciatic Nerve Injury Rats

LU Xin-gang1, YU Li-wei1, GOU Hai-xin1, CHEN Jing-xian2, WU Ye-lin1, SHENG Hui1, WANG Jia-lu1, ZHU Ding-cheng1 (1. Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China; 2. Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

Abstract: Objective To study the effects of one finger massage on sciatic nerve injury rats. Methods The sciatic nerves were exposed, and the sciatic nerve was held by micro needles to make the sciatic nerve injury model. SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group and massage group. In the sham-operation group, the sciatic nerves were exposed but not held. 7 d after the establishment of modeling, rats in massage group received one finger massage for 30 d. After 30 d, SFI and BBB of sciatic nerves were detected. HE staining, transmission electron microscope and immunochemistry assay were used to measure the changes of sciatic nerves. Results Compared with model group, massage group could speed up the recovery of SFI and increase BBB, promote the recovery of sciatic nerve morphology, increased protein level of S-100β, and enhance ultrastructure of newborn nerve growth and recovery. Conclusion One finger massage can effectively promote neurological and functional recovery after sciatic nerve injury in rats.

Key words: one finger massage; sciatic nerve injury; rats

坐骨神经损伤主要发生于幼儿、老年人等,其损伤后神经的再生及功能恢复目前尚无特别有效的方法。一指禅推拿操作强调拇指指面吸定,以快速运动来治疗疾病,临床常用于治疗坐骨神经痛。然而,一指禅推拿对于神经损伤的临床和基础研究较少,本实验观察一指禅推拿对大鼠坐骨神经损伤模型的神经

基金项目:上海市科学技术委员会项目(13401907000);上海

市中医药“杏林新星”行动计划(ZY3-RCPY-2-2031) 形态及功能的影响,为临床应用提供基础。

1 材料与方法 1.1 动物及分组

SPF 级 SD 大鼠 36只,雄性,鼠龄8周左右,体质量 150~170 g,上海西普尔-必凯实验动物有限公司,动物许可证号 SCXK(沪)2013-2016,饲养于复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所动物房,12 h/12 h昼夜交替光照,自由摄食饮水。大鼠适应性喂养 7d后,随机分为假手术组、模型组和推

拿组,每组12 只。

1.2 主要试剂与仪器

水合氯醛(上海凌峰化学有限公司),生理盐水

(上海海尼药业有限公司),S-100β 抗体(美国 Abcam

公司,ab11181)。透射电镜(日本电子有限公司,

JEM-1010),切片机[孚光精仪(中国)有限公司,

HSK-205],显微镜(尼康中国科技有限公司,E-200),

肌电图仪(武汉天鹰医疗设备有限公司,M-800C),

万分之一电子天平(上海利康有限公司,FA-114)。

1.3 造模

参考文献[1]方法制作大鼠坐骨神经损伤模型。大鼠腹腔注射 10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉,俯卧位固定,右侧手术区(右侧臀股交界处)剪毛、酒精消毒,沿坐骨神经走行方向剪开大约1 cm,在梨状肌下缘逐步探寻并暴露坐骨神经,用显微持针器钳夹坐骨神经干30 s,松开 30 s,再夹 30 s,造成神经纤维全部断裂。造模后钳夹伤处坐骨神经组织进行病理学检查,HE 染色显示神经外膜连续性已经消失,神经轴突发生明显断裂,电生理检测发现经有效刺激后

无动作电位产生,判断造模成功[2]。推拿组同模型组。假手术组采用同样方法对大鼠进行预处理,暴露坐骨神经,但不进行夹持,对神经无损伤。

1.4 干预方法

推拿组:首先,对推拿医师进行相关推拿训练,采用一指禅推法(手握空拳,腕掌悬屈,拇指伸直,用拇指的指端、指腹和桡侧偏峰面着力于穴位上,运用腕部的横向来回摆动以带动拇指关节的屈伸活动),要求能实现推拿操作规范化,达到直径约5 mm大拇指末端接触大鼠,频率120 次/min,接触力度为

4 N,待训练合格后开始实验。造模后第 7 日起,将

大鼠固定于大鼠固定架上,参考《实验针灸学》[3]进行穴位定位,选择右侧环跳(后肢髋关节后上缘)、阳陵泉(距后三里上外侧5 mm,在腓骨头前下方凹陷处)、足三里(腓骨小头下约5 mm),待大鼠安静后,按照上述推拿标准对上述穴位进行一指禅推拿,每穴 2 min,并沿足少阳胆经腰部及下肢循行部位一指禅推法移行4 min,注重紧推慢移,全部治疗共计

10 min。每日 1 次,共 30次。模型组和假手术组无相关干预。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学检测 坐骨神经功能指数( sciatic functional index,SFI)为经典反映坐骨神经功能指标。

参考文献[4]制作纸箱(80 cm×10 cm×10 cm),行走道上铺针式打印纸,用印盒将大鼠双后足染色后在箱 中直线行走,在纸上留下 3~4 对足印,量取大鼠手术侧足、正常侧足的相应变量:足印长度(PL),足趾宽度(TS),中间足趾距离(IT)。两侧足区分:实验足一侧(experiment side,E),正常足一侧(normal side,N)。当动物用足背行走或由于足挛缩无法测量PL、TS 或 IT 时,则定 PL=80 mm、TS=6 mm 和

IT=6 mm。测量全部变量后,计算 SFI[-38.3(EPL- NPL)÷NPL + 109.5 ( ETS - NTS)÷NTS + 13.3

(EIT-NIT)÷NIT-8.8]。SFI=0 为正常值,SFI≤

-100 为神经完全断离。

1.5.2 大鼠运动功能评价 大鼠右下肢运动功能恢复情况参考 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分[5],最高分为 21分,分数越高,运动功能越强。

1.5.3 坐骨神经病理学形态观察 HE 染色观察大

鼠坐骨神经形态[6],石蜡切片染色5 min,脱水 10 min,二甲苯透明2 min,中性树脂封片,普通显微镜下观

察神经组织特征、结构完整度。S-100β 是重要的参与神经系统修复的蛋白,表达水平越高神经修复活动越强,免疫组化观察 S-100β 表达水平[6]。大鼠治疗结束后,取出坐骨神经,选取损伤段10 mm,4%多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋,切成5 μm薄片。60 ℃恒温箱中烘烤 20 min,无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇梯度脱蜡各5 min,PBS 洗 3 次×5 min,配制新鲜的 3%甲醇-H2O2溶液,室温封闭 5 min,抗原修复,

S-100β 一抗 37 ℃、孵育1h,生物素二抗 37 ℃、孵育 20 min,添加 SABC 37℃、孵育 20 min,PBS洗 4 次×5 min,Diaminobezidin(DAB)染色 20 min,

75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇梯度脱水各 5 min,二甲苯透明2 min,封片,镜检,各组随机抽取 3 张图片,每张图片随机选取2个视野观察 S-100β 蛋白表达,用 Image-Plus6.0 软件对 S-100β 蛋白平均光密度进行半定量分析。

1.5.4 坐骨神经超微结构电镜观察 参考文献[7]电镜观察各组大鼠坐骨神经超微结构。取大鼠右侧坐骨神经损伤处 10 mm,取新鲜组织 2.5%戊二醛前固定

2 h,再漂洗,1%锇酸后固定1 h,梯度丙酮脱水,环

氧树脂包埋,半薄切片定位,切片(50 nm),柠檬酸铅染色。透射电子显微镜观察有髓神经纤维髓鞘、轴索、雪旺细胞的结构形态和分布情况。生物医学图像分析系统测量有髓神经轴突直径、髓鞘厚度。

1.6 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示,组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异—

有统计学意义。

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