左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马星形胶质细胞神经营养的影响

杨蕙1,王宇红 2,杜青 2,韩远山 1,孟盼 2,刘检 1,刘林 1,赵洪庆 1

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:国家自然科学基金(81403379、81373578、81573965、81603604);湖南省自然科学基金(2016JJ4064)通讯作者:王宇红,E-mail:philomena_yh@sina.com

1.湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007;

2.湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地,湖南 长沙 410007

摘要:目的 研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠海马星形胶质细胞神经营养功能的保护作用。方法 采用复合方法建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型。实验大鼠随机分为模型组、阳性药组和左归降糖解郁方高、中、低剂量组,每组12 只,另取 12 只 SD大鼠作为正常组。各给药组给予相应药物灌胃,连续4周。旷场实验检测大鼠抑郁行为,免疫组化检测大鼠海马星形胶质细胞标记物特异性蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经元细胞标记物微管相关蛋白 2(MAP2)的表达,Western blot 和 RT-PCR 检测大鼠海马星形胶质细胞营养分泌物脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠活动次数明显减少,海马GFAP 表达明显增加,MAP2、BDNF、GDNF、NGF表达明显减少;左归降糖解郁方干预后,模型大鼠抑郁行为明显改善,大鼠海马BDNF、GDNF、NGF、

MAP2 表达增加,GFAP表达明显减少。结论 左归降糖解郁方可有效改善大鼠海马星形胶质细胞的分泌功能,其可能通过增强星形胶质细胞的营养作用保护神经元,从而发挥抗抑郁作用。关键词:左归降糖解郁方;糖尿病并发抑郁症;星形胶质细胞;神经营养;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.011

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)09-0043-05

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription on Neurotrophic Effects of Astrocytes in

Diabetes Mellitus Rats with Depression YANG Hui1, WANG Yu-hong2, DU Qing2, HAN Yuan-shan1, MENG Pan2, LIU Jian1, LIU Lin1, ZHAO Hong-qing1 (1. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. Training Bases, Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry, Changsha 410007, China)

Abstract: Objective To investigate the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription on neurotrophic effects of astrocytes in diabetes mellitus rats with depression. Methods The diabetes mellitus with depression rat models were established by composite method, and then were randomly divided into 5 groups: model group, positive group, Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription high-, medium-, low-dose groups, with 12 rats in each group. 12 normal rats were set as control group. Each administration group was given relevenat medicine for gavage for continuous 4 weeks. Open-field test was used to evaluate the depression-like behavior. The expression of GFAP in astrocyte and MAP2 in neuron were tested by immunohistochemistry. The expression of protein and mRNA of BDNF, GDNF, and NGF were tested by Western blot and RT-PCR. Results Compared with the control group, the activities of rats in model group were significantly reduced. The expression of GFAP increased, while the expressions of MAP2, BDNF, GDNF and NGF decreased. Compared with the model group, the depression-like behavior of rats in model group were significantly improved. The expression of GFAP decreased, while the expressions of MAP2, BDNF, GDNF and NGF increased, and GFAP decrseaed significantly. Conclusion The secretion function of astrocyte can be improved by Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription. Its anti-depression and neuron-protection function might be correlated with the enhancement of neurotrophic effects of astrocytes.

Key words: Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription; diabetes mellitus with depression; astrocyte; neurotrophy; rats

研究发现,糖尿病并发抑郁症占糖尿病患者比例高达 38.35%,其中轻度抑郁症为 26%,中度为 9.6%,中重度为 2.9%,重度为 0.7%[1]。目前治疗用药较少、研发滞后,与高患病率形成了鲜明对比。左归降糖解郁方是在左归丸基础上加减而得,课题组前期研究发现,其可有效降低糖尿病并发抑郁症模型大鼠血糖,改善胰岛素抵抗;行为学研究发现,其可增加大鼠的不动行为,增强学习记忆能力;形态学研究结果表明,

模型大鼠海马病理损伤在给药后显著减轻[2-4]。此外,课题组还发现,左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症

大鼠海马星形胶质细胞同样具有保护作用[5]。星形胶质细胞是中枢神经系统内比重较大的一类胶质细胞,在神经元的整个发育过程中起重要作用。目前针对糖尿病并发抑郁症的研究多集中于对高糖、胰岛素抵抗、神经元功能可塑性等方面展开,较少有星形胶质细胞在其中的重要作用的研究。左归降糖解郁方是否通过影响星形胶质细胞-神经元相互作用保护神经元,进而发挥抗抑郁的作用,尚未见报道。本实验以星形胶质细胞的神经营养作用为主,采用免疫组化、Western blot、RT-PCR 检测星形胶质细胞和神经元的标记物及海马星形胶质细胞的3种分泌物脑源性神经营养因子( BDNF )、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)的表达,初步研究左归降糖解郁方对星形胶质细胞分泌功能的影响及对神经元的保护作用。1 实验材料1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠 72只,体质量 180~220 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号SCXK(湘)2013-0004。饲养于湖南中医药大学 SPF级动物房,温度 20~24 ℃、相对湿度 40%~60%,自由摄食饮水,实验前适应性饲养3 d。1.2 药物

左归降糖解郁方(黄芪18 g,贯叶连翘3g,姜黄9g,熟地黄 15 g,山萸肉 12 g,枸杞子 12 g,菟丝子9g,杜仲 9g,丹参 12 g,牡丹皮 6 g,牛膝 9 g),上述饮片购自本院中药房,由制剂室煎制;盐酸二甲双胍片,湖南湘雅制药有限公司,批号150123;盐酸氟西汀胶囊,法国 Patheon,批号 SS41A。1.3 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(STZ,Solarbio),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白 2(MAP2)兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德有限公司),BDNF、GDNF、NGF 兔抗大鼠多克隆抗体(abcom 公司);即用型

SABC-AP 试剂盒和 Western 用二抗 IgG-HRP(武汉博士德有限公司)。Open-field 敞箱(美国东乐自然基因生命科学公司), mini protean 3 cell 型电泳仪(BIO-RAD 公司),PS-9型电转仪(大连竞迈科技有限公司),PCR 仪(BIO-RAD 公司),Olympus 生物显微镜(日本 OLYMPUS 公司),DVP-W7 显微镜图像处理系统(南京长城信息系统公司)。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

采用高脂灌胃/STZ/慢性应激方法建立糖尿病并

发抑郁症动物模型[6]。实验大鼠随机分为模型组、阳性药组(二甲双胍 0.18 g/kg+氟西汀 1.8 mg/kg)和

左归降糖解郁方高、中、低剂量组(20.53、10.26、

5.13 g/kg),每组 12 只,另取 12 只 SD大鼠作为正常组。阳性药组大鼠予二甲双胍 18 mg/mL 和氟西汀

0.18 mg/mL,左归降糖解郁方高、中、低剂量组大鼠分别予 2.053、1.026、5.13 g/mL左归降糖解郁方水煎液,正常组和模型组给予等量蒸馏水。各组大鼠给药体积均为 10 mL/kg,连续 28 d。2.2 样本采集与处理

各组大鼠采用水合氯醛麻醉后,取6只用于免疫组化实验,另6 只做 PCR 和 Western blot 实验。免疫组化样本处理方法:处死大鼠,打开胸腔,从心尖入针,剪开心耳,4%多聚甲醛进行灌注,用以固定蛋白及冲去脑中血液,取全脑并浸泡于4%多聚甲醛中。PCR 和 Western blot样本处理方法:处死大鼠并于冰台上迅速取出全脑,剥离海马,一分为二,液氮冻存。2.3 指标检测

2.3.1 旷场实验 长 100 cm×宽 100 cm 敞箱底部划分 25个面积相等方格。实验时保证环境光线昏暗,大鼠适应 1.5 min 后,记录大鼠3 min 内敞箱中活动情况。四爪每次全部经过方格则水平活动次数加 1,前两爪每次腾空或攀附在箱壁上则垂直活动次数加

1。实验结束后,分别对各组大鼠在水平和垂直方向上的得分进行统计。

2.3.2 免疫组化检测 固定好的大鼠全脑冲洗后,采用梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡并包埋形成蜡块。切片后,脱蜡,水化,并做抗原修复,随后染色。滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育20 min,甩去多余液体,分别滴加兔抗大鼠 GFAP(1∶400)和 MAP2

抗体(1∶400),4 ℃孵育过夜。PBS 洗 3 次,加入辣根酶标记羊抗兔 IgG 多聚体,室温孵育后 PBS 漂洗。滴加SABC,室温孵育 30 min,PBS 洗 3 次。DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。采用图像分

析系统采集图像分析海马MAP2和GFAP的染色平均光密度值。

2.3.3 Western blot 检测 取大鼠海马加入预冷的

裂解液并于冰上匀浆,4 ℃、12000 r/min 离心 20 min。测定总蛋白含量,并取等量蛋白质电泳分离,分离后移至 PVDF 膜,封闭2 h,TTBS 洗 3 次×5 min,4 ℃孵育过夜,TTBS洗 3 次×5 min,加入二抗孵育 2 h。采用 ECL化学发光法进行检测。

2.3.4 RT-PCR 检测 取大鼠海马按 50~100 mg 组

织/1 mL Trizol 加入 Trizol,搅碎,静置;按 200 μL

氯仿/1 mL Trizol 比例加入氯仿,室温放置5 min;低温离心 15 min取上清液,加入等体积异丙醇,低温高速离心10 min,吸出上层液;按100 μL 75%乙醇/1 mL Trizol 比例加入乙醇,悬浮沉淀,低温高速离心5 min,弃上清液,重复1次。干燥5 min,10~25 μL RNasinfree H2O 溶解得总RNA。反转录 RNA 成 cDNA,在

50 μL cDNA反应液内分别加入2 μL 引物(BDNF:

5'-GAAACCGTCTAGAGCAATATC-3',5'-GGTGGAA

CTGGATGAAGTACTACC-3',产物长度 142 bp;NGF:

5'-CTAAACTTCAGCATTCCCTTGAC-3' , 5'-CCCAA

CACCATCACCTCCTTG-3',产物长度 153 bp;GDNF:

5'-ATTTTATTCAAGCCACCATCAAAAGACTG-3',5'CAATAAATATCTTCTCTATATCTCTGTATTTG-3',产物长度 163 bp),RT-PCR 反应循环为 95 ℃、30 s,

95 ℃、5 s,持续 40 个循环和 60 ℃、30 s。以 β-actin

基因(5'-GACTACCTCATGAAGATCCTCAC-3',5'-CT

CCTTGATGTCCCGCACG-3')作为内参,产物长度

159 bp。采用 2-ΔΔCt方法分析相对基因表达差异。3 统计学方法采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s— 表示,组间各指标比较采用方差分析、t检验和双

侧检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 旷场实验结果

与正常组比较,模型组大鼠水平和垂直活动次数

显著减少(P<0.01);与模型组比较,阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠水平和垂直活动次数显

著增加(P<0.05,P<0.01)。结果见表 1。4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2表达的影响

正常大鼠海马星形胶质细胞胞体和树突均呈MAP2 和 GFAP免疫阳性细胞,其胞质呈均匀弥漫性染色,形态呈星形,突起为放射状或星状,长短不一。与正常组比较,模型组神经元MAP2表达明显减弱, GFAP 表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠海马 MAP2阳性表达显著增加,GFAP表达显著降低(P<0.05, P<0.01)。结果见表 2、图 1、图 2。

4.3 左归降糖解郁方对模型大鼠脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子和神经生长因子蛋白表达的影响与正常组比较,模型组大鼠海马BDNF、GDNF、

5讨论

左归丸用于治疗糖尿病历史悠久,课题组结合糖尿病并发抑郁症的现代疾病特点,通过加减配伍,得到左归降糖解郁方。实验发现,其可通过降低海马中皮质酮的含量,保护海马神经元,唤醒负反馈调节机制,缓解模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱,进而对糖尿病并发抑郁症大鼠实现整体治疗[7]。

然而,皮质酮不仅损伤海马神经元,同时还会损伤海马星形胶质细胞。糖尿病状态下,皮质酮含量异常升高可加重其对星形胶质细胞的损伤。Moghaddam H K等[8]通过检测星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 发现,STZ诱导的糖尿病大鼠海马星形胶质细胞异常增 NGF表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,阳性药组和左归降糖解郁方中、高剂量组大鼠海马BDNF、GDNF、NGF 表达显著升高(P<0.05,P<0.01))。结果见表3、图 3。

— 生。星形胶质细胞是神经元的环境细胞,其对神经元起到支持、稳定、营养修复神经元等多重作用,同时其还可通过调节神经细胞内、外离子浓度和传递第二信使,摄取、灭活和供给神经递质等作用参与神经元

的功能发挥[9]。因此推测,糖尿病状态下,体内皮质酮水平持续升高损伤海马导致抑郁症的发生,可能不仅只与神经元有关,更可能通过损伤海马星形胶质细胞,影响神经元的内环境,导致神经元更加脆弱,损伤亦进一步加重。本实验以GFAP 和 MAP2 分别作为星形胶质细胞和神经元细胞的标记物,免疫组化结果显示,糖尿病并发抑郁症大鼠海马GFAP表达显著增

加,MAP2表达显著减少,提示星形胶质细胞存在明

显的增生,而海马神经元细胞存在一定程度的损伤。给予左归降糖解郁方后,模型大鼠GFAP 表达减少,

MAP2表达增加,星形胶质细胞和神经元细胞损伤均有所减轻。

神经营养是星形胶质细胞对神经元的多种作用中极为重要的一种。该作用与星形胶质细胞的分泌功

能密切相关。闰荣等[10]通过体外实验发现,星形胶质细胞可通过神经营养作用促进神经元样细胞的分化。糖尿病皮质酮升高是否可通过损伤海马星形胶质细胞影响其分泌功能,通过改变分泌物的含量影响神经元的形态与功能,产生抑郁症值得研究。星形胶质细胞可分泌 BDNF、GDNF、NGF 等多种神经营养因子。其中,BDNF是神经营养因子家庭中的重要成员,其对神经元具有分化、增殖、营养、成熟的作用,能增强突触联系,影响神经元的可塑性和神经递质、神经营养因子的合成,且与长时程增强效应及学习记忆功

能有关[11]。GDNF 是转化生长因子β超家族的成员之一,主要来源于星形胶质细胞,对胆碱能神经元、海马神经元存活有营养作用,同时可对抗神经元凋亡,

参与糖尿病脑病的发生[12]。而 NGF 是一类对神经元的分化和突起的生长、存活及功能起支持促进作用的

蛋白质,具有促进神经再生和修复的作用[13]。因此,本实验采用 BDNF、GDNF、NGF 为代表,研究发现,糖尿病并发抑郁症大鼠海马中上述指标含量均明显降低,而给予左归降糖解郁方后含量均显著升高。

综上,本研究结果表明,左归降糖解郁方可能通过有效改善模型大鼠海马星形胶质细胞的分泌功能,保证对神经元的营养供应,保护神经元损伤,进而发挥抗抑郁的作用。

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(收稿日期:2017-01-20)

(修回日期:2017-02-21;编辑:华强)

注:与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01

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