补肾中药对肾虚质大鼠生长发育及脑组织胆碱乙酰化酶含量的影响

孙瑜嬬,孙理军,孙耀光,张琪,刘熙如,柏云飞

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046

摘要:目的 探讨补肾中药对肾虚体质大鼠生长发育及脑组织胆碱乙酰化酶(CHAc)含量的调节作用。方法 采用“猫吓鼠”方法制作先天不足加后天失养复合型肾虚模型。造模大鼠随机分为模型组、左归丸组和右归丸组,空白组大鼠产自正常孕鼠。对仔鼠恐吓同时开始灌胃给药,药物组给予左归丸和右归丸混悬液,空白组和模型组予等量生理盐水,每日1次,连续3个月。观察大鼠生长发育一般状况,记录5~8周龄各组大鼠体质量和平均食物利用率,ELISA检测大鼠脑组织CHAc含量。结果 仔鼠 5~8周龄时,模型组较空白组

体质量明显减少(P<0.01),左归丸组和右归丸组体质量较模型组明显增加(P<0.05,P<0.01),平均食物利用率与体质量呈正相关;模型组脑组织CHAc含量较空白组明显降低(P<0.01),左归丸组、右归丸组较模

型组明显升高(P<0.01)。结论 补肾中药可改善肾虚质大鼠生长发育落后状态并调节脑内CHAc含量,从而提高肾虚质大鼠学习记忆能力。

关键词:补肾中药;生长发育;胆碱乙酰化酶;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.012中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)09-0048-03 Effects of Kidney Reinforcing Medicine on Growth and Development and Brain Choline

Acetyl Transferas Content of Rats with Kidney-deficiency Constitution SUN Yu-ru, SUN Li-jun, SUN Yao-guang, ZHANG Qi, LIU Xi-ru, BO Yun-fei (Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

Abstract: Objective To discuss the adjustment effects of kidney reinforcing medicine on growth and development and the content of choline acetyl transferase (CHAc) in rats with kidney-deficiency constitution. Methods The method of “cats scare rats” was used to build composite offspring rat models with deficiency and acquired dystrophy, and then the models were divided into model group, Zuogui Pill group and Yougui Pill group. The rats in blank group came from normal pregnant rats. Baby rats were scared and received gavage at the same time. All administration groups received suspension of Zuigui Pills or Yougui Pills. Blank group and model group received the same amount of normal saline, once a day, for 3 months. Growth and development of rats were observed. Weight and food utilization of rats aged 5–8 weeks in each group were recorded. The content of brain CHAc was detected by ELISA. Results When offspring were 5–8 weeks old, weights of rats in the model group were lower than blank group (P<0.01); while weights of rats in Zuogui Pill group and Yougui Pill group increased significantly (P<0.05) and the food utilization was positively correlated with weight; the CHAc content in the model group decreased significantly compared with blank group (P<0.05, P<0.01); while the CHAc content in Zuogui Pill group and Yougui Pill group increased significantly compared with the model group (P<0.01). Conclusion Kidney reinforcing medicine can improve backward growth and development of rats with kidney-deficiency constitution and adjust CHAc in the brain, so as to promote the learning and memory ability of rats with kidney-deficiency constitution.

Key words: kidney reinforcing medicine; growth and development; CHAc; rats

以肾中精气亏虚、肾脏功能低下为主要表现的肾虚体质,是各类人群中常见的体质类型之一。中医理论有“肾主生殖、主蛰守位、在志为恐、在窍二阴”。前期研究表明,肾虚体质模型动物较正常群体出现精神萎靡、瑟缩不动、敏感易惊、饮食饮水量少、体质量偏轻、生长发育迟缓、皮毛松弛、毛发稀疏等一系列临床现象[1]。一方面“肾藏精生髓”,肾精不足无以充髓实脑而致脑失其用;另一方面“恐伤肾”,恐惧不解则致肾精亏虚、脑窍失养。本研究以肾虚体质模型大鼠生长发育情况及脑组织胆碱乙酰化酶(CHAc)含量为研究对象,探讨补肾中药对肾虚体质生长发育及脑功能衰退的调节作用。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级 12 周龄 SD 大鼠雄性 5 只、未受孕雌性10 只,体质量 300~350 g,第四军医大学实验动物研究中心,动物许可证号 SCXK(陕)2014-001,3 月龄雄性土猫1只,鲜活小鼠。自由摄食饮水,室温喂养。1.2 药物、试剂和仪器

左归丸(批号 120607)、右归丸(批号 150310),河南宛西制药股份有限公司。CHAc ELISA 试剂盒,艾莱萨生物科技(上海)有限公司,批号3646。全自动酶标仪(瑞士哈美顿),高速组织匀浆机(江苏金坛中大仪器厂),低速离心机(上海安亭/飞鸽)。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

参照本课题组前期研究方法[1],大鼠适应性饲养

7 d,10只雌鼠随机分成恐吓组6只、正常组4 只,分别与雄鼠合笼交配。成功受孕后恐吓组孕鼠置于特质鼠笼,每日 9:00-21:00 置于猫笼旁被恐吓,同时在猫笼内放置鲜活小鼠令其捕食,使孕鼠在旁观望持续处于恐慌状态至产子;正常组不予恐吓自然分娩。待 2组所产仔鼠4周龄时,将正常组孕鼠所产仔鼠随机 8 只作为空白组,将恐吓组母鼠所产仔鼠随机 24只分为模型组、左归丸组和右归丸组,每组8只,继续对此3组仔鼠进行恐吓,持续4 周。按文献[2]公式换算,大鼠用药量约为成人6.25 倍。左归丸成人服药 量 18 g/d,大鼠给药量为 1.875 g 原药材/(kg·d),蒸馏水配制成 1.875 g/mL混悬液备用。右归丸成人服药量 9 g/d,大鼠给药量为 0.937 5 g 原药材/(kg·d),蒸馏水配制成 0.937 5 g/mL混悬液备用。对仔鼠恐吓的同时开始灌胃给药,药物组给予上述制备好的混悬液,空白组每日给予等量生理盐水10 mL/kg,每日 1次,每周用药5 d 停 2 d,连续 3个月。2.2 生长发育观察每日 8:00观察各组大鼠活动状态,记录5~8周龄各组仔鼠体质量和进食情况。2.3 胆碱乙酰化酶含量检测

末次给药1h后断头处死,冰上迅速剥离海马, 4 ℃生理盐水冲洗,滤纸吸干水分,称重后置液氮冻存。制备 10%海马组织匀浆,3000 r/min 离心5 min,取上清液,严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作,于酶标仪 450 nm处测定 CHAc 含量。3 统计学方法采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s— 表示,组间比较采用独立样本t 检验。P<0.05 表

示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

模型组较其他各组精神萎靡、瑟缩不动、敏感易惊、饮食水量少、体质量轻、生长发育迟缓、皮毛松弛、毛发稀疏且光泽度低、大便质软/不成形、小便多。4.2 补肾中药对仔鼠体质量的影响

模型组仔鼠自5周龄开始至8周龄,体质量均较

空白组下降(P<0.01),提示肾虚质模型动物生长缓慢。经药物干预后,周龄相同的左归丸组与右归丸组

仔鼠体质量均较模型组更趋向正常水平(P<0.05,

P<0.01)。结果见表 1。4.3 补肾中药对仔鼠进食情况的影响

随着仔鼠周龄的增加,各组仔鼠进食均有所增多。但与相同周龄仔鼠间比较,模型组仔鼠进食均远低于空白组,且经过药物干预的左归丸组和右归丸组仔鼠进食水平较肾虚质有所改善且更趋于正常水平。结果见表2。

5 讨论

本实验采用“猫吓鼠”经典方法造模,观察被恐吓孕鼠,其日常活动明显减少,喜蜷缩角落、目光恐惧、极其敏感易惊、大便质软甚至不成形、小便增多,且出现早产现象,正常母鼠基本于合笼后 18~22 d陆续产子,而被土猫恐吓的孕鼠合笼后第 15 日便产子。同时被恐吓的孕鼠生殖率低于正常孕鼠,上述现象充分体现了中医藏象理论中肾主生殖、主蛰守位、在志为恐、在窍二阴的生理特性。

观察各组仔鼠一般情况发现,模型组较其他各组出现精神萎靡、瑟缩不动、敏感易惊、饮食饮水量少、体质量偏轻、生长发育迟缓、皮毛松弛、毛发稀疏且光泽度低、大便质软或不成形、小便较多等一系列符合中医肾虚体质临床特点的现象;解剖时发现模型组2只仔鼠胸廓畸形,胸骨偏向右侧,心脏异位。肾主骨、主生长发育,肾虚质仔鼠骨骼脏器发育的异常符合中医肾虚体质的临床特点。模型组大鼠体质量显著降低,表明肾虚质仔鼠由于先天禀赋不足加后天情志损伤,致肾精亏损,出现发育缓慢甚至畸形的肾虚质表现。

“肾虚则智不足”(《医学心悟》),“肾藏精生髓”,脑为髓海,主神志思维,司机体运动,故肾虚则精不上承而脑髓空虚、脑窍失养致脑失其用。肾精足,脑髓化生有源,脑髓足,则神旺;肾精虚则髓乏,不能

上充于脑,表现为学习记忆能力降低和健忘神衰等[3-5]。中枢胆碱能系统可通过大脑边缘系统及大脑皮

层调节机体的学习记忆能力[6-8]。乙酰胆碱(Ach)是中枢胆碱能神经系统中重要神经递质之一,脑内细胞 外液中 Ach 浓度与学习记忆能力密切相关。同时, Ach 与不同胆碱能受体结合后可影响相应腺体的分泌,以及平滑肌的收缩、骨骼肌的发育、神经元的兴奋等,故 Ach的含量变化可充分反映机体的生长发育状况和学习记忆能力。CHAc作为一种转移酶,是胆碱能神经元中的特殊标志酶,也是合成Ach 的关键,只有在CHAc的催化下胆碱才能和乙酰辅酶A结合生成 Ach。可以说脑内 CHAc 与 Ach神经元几乎平行分

布[9-10],故 CHAc 是反映机体学习记忆能力及生长发育状况的必要指标。比较各组大鼠脑组织CHAc 含量差异发现,与空白组比较,模型组显著降低;与模型组比较,左归丸组和右归丸组显著升高;左归丸组和右归丸组间虽存在差异但无统计学意义。故肾虚质大鼠生长发育迟缓及学习记忆能力降低的机制与其脑内 CHAc含量的减少密切相关,同时左归丸和右归丸对其具有改善和提高作用。先天不足加后天失养的复合型肾虚质动物模型体现了中医整体观念,符合中医情志致病的病因学原理,符合中医肾的藏象学理论,具有操作的可行性。本实验结果表明,通过左归丸和右归丸2种补肾药物的干预治疗,可明显改善肾虚质大鼠的生长发育和升高脑CHAc含量,为临床肾虚体质相关疾病和亚健康的防治提供实验依据。参考文献:

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(收稿日期:2017-02-13)

(修回日期:2017-03-15;编辑:华强)

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