芩麻方对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎性细胞相关因子的影响

丁亚杰1,陈晓 2,俞仲毅 2,邹纯朴 1

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - (收稿日期:2017-04-19) (修回日期:2017-05-04;编辑:华强)

1.上海中医药大学基础医学院,上海 201203;2.上海中医药大学科技实验中心,上海 201203摘要:目的 观察芩麻方对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠内源性抗炎系统的影响,探讨其作用机制。方法 采用改良烟熏联合脂多糖方法制作COPD大鼠模型。将70 只 SPF级大鼠随机分为正常组、模型组、西药对照组(氨茶碱组)、中药对照组(六君子汤组)和芩麻方低、中、高剂量组,每组10只,各给药组给予相应药物灌胃。光镜下观察大鼠肺组织病理切片;收集大鼠肺泡灌洗液(BALF)和静脉血,对相关指标进行检测;ELISA 检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10 含量。结果 与正常组比较,模型组大鼠BALF 和血

白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血红蛋白和血小板压积显著增加(P<0.05);与模型组比较,芩麻方中、高剂量组和六君子汤组大鼠BALF白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞显著减少(P<0.05),芩麻方中、

高剂量组和氨茶碱组大鼠血白细胞、血红蛋白和血小板压积显著减少(P<0.05),血清 IL-1β、IL-6 含量显著

降低(P<0.05),IL-10 含量显著升高(P<0.05)。结论 芩麻方通过调节炎症反应相关细胞因子从而抑制炎症反应。

关键词:芩麻方;慢性阻塞性肺疾病;白细胞介素-1β;白细胞介素-6;白细胞介素-10;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.014

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)09-0055-04

Effects of Qinma Formula on Inflammatory Cell Related Factors in Rats with Chronic

Obstructive Pulmonary Disease DING Ya-jie1, CHEN Xiao2, YU Zhong-yi2, ZOU Chun-pu1 (1. Basic Medicine College, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Scientific Experimental Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Abstract: Objective To investigate the effects of Qinma Formula on endogenous anti-inflammatory system in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD); To discuss its mechanism of action. Methods Rat models of COPD were made by modified smoked lipopolysaccharide method. 70 healthy SPF male Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, Western medicine control group (aminophylline group), TCM medicine control group (Liujunzi Decoction group) and Qinma Formula high-, medium-, and low-dose groups, with 10 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage. The pathological changes of lung tissue were observed under light microscope; the alveolar lavage fluid (BALF) and venous blood were collected and the related indexes were tested; the levels of serum IL-1β, IL-6 and IL-10 were detected by ELISA. Results Compared with normal group, BALF white blood cells, neutrophils, macrophages, lymphocyte, hemoglobin and platelet count in rats of model group increased significantly (P<0.05). Compared with the model group, BALF white blood cells, neutrophils, and macrophages in rats of Qinma medium- and high-dose groups and Liujunzi Decoction group decreased significantly (P<0.05); white blood cells, hemoglobin, and platelet count in rats of Qinma medium-, high-dose groups and aminophylline group decreased significantly (P<0.05); levels of IL-1β and IL-6 in serum decreased significantly (P<0.05); level of IL-10 in serum increased significantly (P<0.05). Conclusion Qinma Formula can effectively inhibit the inflammatory response through the regulation of inflammatory response-related cytokines.

Key words: Qinma Formula; chronic obstructive pulmonary disease; IL-1β; IL-6; IL-10; rats

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)主要是慢性吸烟和暴露于各种有害气体和颗粒的结果所致,其特征是可逆的气流受限和进行性气道炎症。芩麻方是上海中医药大学终身教授、国医大师裘沛然教授的临床经验用方,由麻黄、黄芩、细辛、诃子等组成,具有辛开苦降、寒热并用和散敛相合的功效,为治疗咳喘病之效方。本课题前期临床研究显示,芩麻方能显著缓解COPD 的症状,改善患者肺功能[1]。本实验采用改良烟熏联合脂多糖方法制作 COPD 大鼠模型,观察芩麻方对 COPD 大鼠内源性抗炎系统的影响,探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

健康雄性 SPF 级 Wistar 大鼠,鼠龄 10~12 周,体质量 180~220 g,上海必凯实验动物公司,动物合格证号 2008001655632。饲养于上海中医药大学动物

实验中心,12 h/12 h明暗周期,温度(20±2)℃、

相对湿度(50±5)%,自由摄食饮水。

1.2 药物

芩麻方(麻黄、细辛、黄芩、诃子等),药物浸膏粉由上海中医药大学中药工程实验室提供,每贴相当于浸膏 6.5 g;氨茶碱片,山西云鹏制药有限公司,批号 B141104,0.1 g/片;六君子汤(人参、茯苓、白术、炙甘草、陈皮、法半夏、生姜、大枣),由上海中医药大学曙光医院药剂科提供饮片并煎煮。

1.3 主要试剂与仪器

脂多糖(美国 Sigma 公司),胃蛋白酶(上海威奥生物技术有限公司)。光学显微镜(Nikon YS IOO

型),木质半透明烟熏箱(52 cm×40 cm×28 cm,自

制),BY210 型生物机能实验分析系统(成都泰盟科技有限公司),酶标仪(Therme DENLEY DRAGON Well-scan MK3),细胞计数仪分析(迈瑞 bc5800), Image-ProPlus 6.0 图像分析软件(Media Cybernetics),香烟(黄果树牌香烟,焦油含量11 mg),白细胞介素

(IL)-1β、IL-6 和 IL-10 ELISA 试剂盒(上海威奥科技有限公司)。

2 实验方法 2.1 分组

将 70 只大鼠随机分为正常组、模型组、西药对照组(氨茶碱组)、中药对照组(六君子汤组)和芩麻方低、中、高剂量组,每组10 只。

2.2 造模

参照文献[2]方法造模。造模第1日,微量注射器气管内注入 1 μL 二硫酰氯溶液(遇空气分解为二氧 化硫),吸入二氧化硫。造模第 2、15 日,造模组大鼠 3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,大鼠仰卧固定,使用自制带探灯注射器,将注射器探入到大鼠声门,找到气管部位,注入50 μL 溶液(PBS 配制,含脂多糖和胃蛋白酶各 200 μg),注入后大鼠出现明显呛咳,迅速旋转固定,使脂多糖和胃蛋白酶均匀分布于两肺。吸入二氧化硫第3日开始,将大鼠置于自制的半透明熏吸箱,每次放入15只大鼠,使用7支香烟,烟熏30 min,每日上午 1次,连续 30 d。

2.3 给药

造模后给药3周,按人与大鼠体表面积折算,芩麻方低、中、高剂量组分别为0.29 g 原药材/kg(临床半量)、0.58 g 原药材/kg(临床用量)、1.17 g 原药材/kg (临床倍量),六君子汤给药量为4.9 g 原药材/kg(临床用量),氨茶碱组为45 mg/kg 药液(临床用量)。

2.4 检测指标

2.4.1 肺组织病理观察 制备大鼠肺组织切片,组织脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,切片,HE染色。

20倍镜下观察病理学改变。

2.4.2 肺泡灌洗液制备及检测 参照文献[3]方法制备。暴露气管及肺脏,夹持右侧主支气管。在气管上部做一T型切口,钝性分离气管,使用10号灌胃针,行气管插管,用生理盐水,进行灌洗液回收,回收后

经滤头过滤,得肺泡灌洗液(BALF),1500 r/min 离心 10 min,吸取上清液,加 37 ℃低渗液8 mL,37 ℃水浴 20 min。再加 1 mL 现配的固定液,1500 r/min离心 10 min。弃上清液,缓慢加入固定液至8 mL,离心 8 min 弃上清液,再加8 mL 固定液,打匀,37 ℃水浴 30 min,1000 r/min 离心 10 min再弃上清液。取

0.1 mL BALF,离心后沉淀于血细胞计数板测定白细

胞。沉淀以快速瑞氏-姬姆试剂盒方法染色。10 倍镜下选取细胞较集中区域拍片,再用图像分析软件对镜下 BALF进行细胞分类计数。

2.4.3 血常规检测 取大鼠静脉血于抗凝管中,血常规试剂盒检测大鼠白细胞、血红蛋白、血小板压积,严格按试剂盒说明书进行操作。

2.4.4 血清细胞因子检测 大鼠腹腔注射 25%乌拉坦麻醉,腹主动脉采血,室温自然凝固10~20 min,

待血液出现分层后,3500 r/min 离心 20 min,收集上清液。ELISA 检测血清 IL-1β、IL-6 及 IL-10 含量,严格按试剂盒说明书进行操作。

3 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示,多组间比较采用方差分析,多组间两两比—

较采用 LSD 法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 芩麻方对模型大鼠肺组织形态的影响

正常组肺泡结构正常,无扩张;模型组肺泡扩张,肺泡结构大量破坏,表现为肺泡融合成较大囊腔,间质内大量淋巴细胞和浆细胞浸润,支气管壁增厚;芩麻方低剂量组气管仍有炎细胞浸润,肺泡结构仍有少量破坏;芩麻方中、高剂量组炎细胞浸润明显减少,肺泡结构较少破坏;六君子汤组大鼠肺组织支气管管

注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05

4.4 芩麻方对模型大鼠血清白细胞介素-1β、白细

胞介素-6 和白细胞介素-10含量的影响与正常组比较,模型组 IL-1β、IL-6 含量显著升

腔和肺泡腔炎性细胞浸润明显,肺泡结构破坏,小支气管可见炎症改变;氨茶碱组仍有炎细胞浸润,肺泡结构破坏减少,肺泡壁增厚。结果见图1。

4.2 芩麻方对模型大鼠肺泡灌洗液白细胞及其分类的影响

与正常组比较,模型组白细胞、中性粒细胞、巨

噬细胞和淋巴细胞显著增加(P<0.05);与模型组比较,芩麻方中、高剂量组和六君子汤组白细胞、中性

粒细胞、巨噬细胞显著减少(P<0.05)。结果见表1。

COPD病理因素复杂,痰浊、水饮和瘀血三者相互影响,辨证多为本虚标实[4]。国医大师裘沛然教授根据临证经验,总结出治疗COPD的芩麻方。咳必治肺,麻黄宣肺解表、细辛解表平喘。外邪由表传里,

入而化热,痰热蕴肺,故予黄芩清上焦之热。痰为浊阴之邪易凝滞,故予细辛等辛温之药以温肺化痰。诃

子性涩,功在敛肺止咳[5]。本方有开、有化、有降、有润,宣敛并用,切中病机。

COPD的发病机制虽然尚未清楚,但其表现为炎性细胞如T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞在气道和肺实质作用的一种慢性气道炎症疾病。气道和肺发生慢性炎症时,产生氧化应激反应,对 α1-抗胰蛋白酶进行氧化并致其失活,这一失活降低抗蛋白酶的活性,产生肺气肿。此外,反复发生的气道炎症还进一步导致气道壁的损伤,使气道发生修复,最终导致气道管壁增厚,造成管腔狭窄,引起气道重塑及发生难以逆转的进行性阻塞。气道中各种炎性细胞如单核细胞、巨噬细胞,主要通过释放多种细胞因子调节COPD病变中慢性气道炎症和气道重塑的过程。

本实验结果显示,模型组血常规、BALF中白细胞较正常组升高,表明造模成功,与实验和临床文献

报告结果相似[6-7]。与模型组比较,芩麻方中、高剂量组白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞均降低,提示芩麻方通过降低中性粒细胞、淋巴细胞来降低白细胞,从而抑制炎症反应。

IL-1β 是一种重要的前炎性介质因子,主要功能在于刺激分泌炎性介质,通过激活凝血系统,进一步抑制纤溶的发生,一方面增加炎性渗出,另一方面加大中性粒细胞溶体酶的释放,产生氧自由基,进而促进炎性细胞如单核细胞、巨噬细胞释放 IL-1、IL-6 等

炎性介质,进一步促进炎症反应的发生与发展。IL-6是由淋巴细胞和多种非淋巴分泌产生,其与肺部炎症密切相关,能促进肝细胞合成C反应蛋白,同时刺激T 淋巴细胞增殖,从而参与炎反应。IL-10 主要由单核-巨噬细胞和辅助性T 细胞合成。IL-10 是一种炎性细胞因子合成抑制因子,可抑制T淋巴细胞、NK细胞释放前炎性细胞因子 IL-1、IL-6 等。本实验结果显示,芩麻方中、高剂量组 IL-1β、IL-6 水平较模型组降低,提示芩麻方通过降低炎性因子水平抑制炎症反 应,芩麻方中、高剂量组 IL-10 含量显著升高,提示芩麻方通过提高机体 IL-10 水平,发挥抗炎作用。

本实验建立的大鼠COPD模型,肺组织形态改变符合 COPD的病理变化,评估本实验造模方法成功可行。通过实验推测,芩麻方主要通过增加抑炎反应因子的表达,降低促炎症因子的数量达到抗炎的目的。芩麻方抗炎作用以高剂量作用明显,中剂量作用次之。

综上,本实验结果显示,芩麻方抗炎主要通过作用于肺组织,调节炎症反应相关细胞因子,从而发挥治疗 COPD 的作用。本实验主要从 COPD 的炎性机制进行初步探究,由于所测指标虽相对较少,后续实验将通过炎性的机制通路相关因子、相关蛋白的表达来进一步验证芩麻方的抗炎机理。

参考文献:

[1] 邹纯朴,黄品贤,余小平,等.裘沛然教授咳喘病诊疗方案的临床效果

评价[J].中华中医药杂志,2013,13(7):2025-2028.

[2] JOBSE B N, McCURRY C A, MORISSETTE M C, et al. Impact of inflammation, emphysema, and smoking cessation on V/Q in mouse models of lung obstruction[J]. Respiratory research,2014,15(1):4250.

[3] 姜素丽,李亚,田燕歌,等.调补肺肾三法对 COPD 大鼠 T 淋巴细胞亚群及 CD4+CD25+的影响及远后效应[J].中国中西医结合杂志,2013,33(11):

1538-1544.

[4] 王庆其,李孝刚,邹纯朴,等.裘沛然治疗咳喘病经验[J].上海中医药

杂志,2010,44(1):1-3.

[5] 马丽佳,曲妮妮,郑忻,等.古代中医文献肺胀病证治方药研究[J].辽

宁中医杂志,2015,42(11):2104-2107.

[6] 程羽,羊忠山,陶伟利,等.慢性阻塞性肺疾病气道重塑与血常规、EPO

相关性的实验研究[J].中华中医药学刊,2016,34(4):807-809.

[7] 蔡玲,黄金城.自拟宣肺平喘汤对慢性阻塞性肺病急性发作患者血常

规、CRP、肺功能、血气分析等指标的影响[J].中华中医药学刊,2014,

32(6):1508-1510.

Newspapers in Chinese (Simplified)

Newspapers from China

© PressReader. All rights reserved.