醒鼻温敏凝胶剂对变应性鼻炎大鼠血清白细胞介素-4、转化生长因子-β1和鼻黏膜嗜酸性粒细胞的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - News -

邱彩霞1,郑健2,林东红1,艾斯1,吴博3,庄翔莉2,翁珂涵1,李旭微 1

1.福建中医药大学附属人民医院,福建 福州 350004;

2.福建中医药大学,福建 福州 350122;

3.福建中医药大学附属第二人民医院,福建 福州 350001

摘要:目的 观察醒鼻温敏凝胶剂对变应性鼻炎(AR)大鼠血清白细胞介素-4(IL-4)、转化生长因子-β1

(TGF-β1)及鼻黏膜嗜酸性粒细胞(EOS)计数的影响,探讨其作用机制。方法 以卵清白蛋白加氢氧化铝腹腔注射基础致敏,局部以2%卵清白蛋白激发成功复制AR模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组和醒鼻低、中、高剂量组,各给药组给予相应药物干预。比较各组大鼠症状评分,检测血清IL-4、TGF-β1含量和鼻黏膜EOS计数。结果 与正常组比较,模型组大鼠血清 IL-4、TGF-β1 含量明显升高(P<0.01),鼻黏膜组织EOS计数明显增加(P<0.05);与模型组比较,醒鼻中剂量组和阳性对照组血清 IL-4、TGF-β1 含量

明显降低(P<0.01),鼻黏膜组织 EOS 计数明显减少(P<0.05)。结论 醒鼻温敏凝胶剂可能通过下调IL-4、

TGF-β1等炎症因子水平及减少鼻黏膜EOS浸润而发挥治疗作用。

关键词:醒鼻温敏凝胶剂;白细胞介素-4;转化生长因子-β1;嗜酸性粒细胞计数;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.011

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)02-0047-04

Effects of Xingbi Wenmin Gel on Serum Levels of IL-4, TGF-β1 and Nasal Mucosa Eosinophils in Allergic Rhinitis Rats

QIU Cai-xia1, ZHENG Jian2, LIN Dong-hong1, AI Si1, WU Bo3,

ZHUANG Xiang-li2, WENG Ke-han1, LI Xu-wei1

1. People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, China;

2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;

3. The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350001, China Abstract: Objective To observe the effects of Xingbi Wenmin Gel on serum levels of IL-4, TGF-β1 and nasal mucosa eosinophils (EOS) in allergic rhinitis (AR) rats; To discuss its mechanism of action. Methods Intraperitoneal injection of egg albumin and aluminum hydroxide based sensitized to ovalbumin challenge 2% local AR model was established successfully. The experimental rats were randomly divided into normal group, model group, positive control group, and Xingbi Gel low-, medium-, and high-dosage groups. Each medication group was given relevant medicine for intervention. The rat symptom scores in each group were compared, and serum IL-4, TGF-β1, and nasal mucosa EOS counts were detected. Results Compared with the normal group, the serum levels of IL-4 and TGF-β1 in model group increased significantly (P<0.01), and the nasal mucosa EOS counts increased significantly (P<0.05). Compared with model group, the serum levels of IL-4 and TGF-β1 in Xingbi Gel medium-dosage group and positive control group decreased significantly (P<0.01), and the nasal mucosa EOS counts decreased significantly (P<0.05). Conclusion Xingbi Wenmin Gel may be effective through down-regulation of IL-4, TGF-β1 levels of inflammatory factors, and reduction of EOS infiltration in nasal mucosa.

Keywords: Xingbi Wenmin Gel; IL-4; TGF-β1; eosinophilia counts; rats

基金项目:国家自然科学基金(81373820);福建省自然科学基金(2015J01683)

通讯作者:郑健,E-mail:zhengjian7816@126.com

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是多种细胞和细胞组分参与的变态反应性疾病,其发病核心机制是鼻黏膜局部免疫球蛋白IgE介导的炎性反应伴嗜酸性粒细胞(EOS)的浸润。流行病学调查显示,AR平均发病率为 10%~21%[1],且发病率呈上升趋势。目前治疗主要针对减少机体炎性反应及 EOS 浸润,临床上以糖皮质激素为主要代表药物,但长期使用会产生一定的不良反应。本实验采用醒鼻温敏凝胶剂治疗 AR 大鼠,观察其对 AR 大鼠血清白细胞介素-4

(IL-4)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及鼻黏膜 EOS计数的影响。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级 SD 大鼠 90 只,3~4 周龄,雌雄各半,

体质量(220±20)g,上海斯莱克实验动物有限公司,动物许可证号 SCXK(沪)2012-0011。饲养于福建中医药大学实验动物中心 SPF 级实验室,光暗周期为

12 h/12 h,温度(25.0±0.5)℃,相对湿度 50%~70%,大鼠适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药物醒鼻温敏凝胶剂(人工牛黄、蝉蜕、冰片、薄荷、徐长卿等),福建中医药大学附属人民医院药剂科提供,批号 20160927;雷诺考特,阿斯利康制药有限公司,批号 GH506。

1.3 主要试剂与仪器卵清白蛋白(OVA,SIGMA 公司),批号 A5503;氢氧化铝(SIGMA 公司),批号 BE084672;IL-4、

TGF-β1 ELISA 试剂盒(R&D公司),批号 0675481; HE 染色试剂盒(上海碧云天生物科技公司),批号

C0105;福尔马林试剂(上海威奥生物科技)。CS-1EAS型电子天平(北京市菲姆斯科技开发公司),低速离

心机(湖南湘仪),CUT4060 型石蜡切片机(德国莱卡),倒置显微镜(日本 OLYMPUS 公司),全自动酶标仪(瑞士 TECAN 公司)。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[2]方法。①基础致敏,每只大鼠以OVA

0.5 mg作抗原,氢氧化铝粉末30 mg作佐剂,加生理盐水 1 mL形成混悬液,腹腔注射,隔日1 次,共 7次。②局部激发,在腹腔注射致敏完成后第4日,大鼠取头低位,用微量加样器每侧鼻腔滴预先配制的

2%剂量 OVA 溶液 50 μL激发,隔日1次,共5 次。激发时间为当日第 1 次滴鼻给药 1 h 后。参照 1997年(海口)修订的全国变应性鼻炎诊断及疗效评定标 准,每次 OVA双侧鼻腔滴鼻激发后,观察记录30 min内大鼠喷嚏、搔鼻次数、流涕量,采用叠加法计算总

分,总分(a+b+c)≥5分表示造模成功。a.喷嚏:一次连续3~9 个为1 分,10~14 个为2 分,≥15 个为 3 分。b.鼻痒:搔鼻 2~3 次为 1 分,3~5 次为 2

分,5 次以上为 3 分。c.流涕:流至鼻孔为 1 分,超过前鼻孔为2分,流涕满面为3 分。

2.2 分组及给药

SD大鼠随机抽取15只为正常组,成模大鼠随机

分为模型组、阳性对照组和醒鼻低(12.5 μg/mL)、中

(25 μg/mL)、高(50 μg/mL)剂量组,每组 15 只。各给药组均于第 7 次(第 21 日)致敏注射后次日开始给药,大鼠取头低位,阳性对照组给予雷诺考特药液滴鼻,醒鼻各剂量组给予醒鼻温敏凝胶剂滴鼻,滴入量为 50 μL/侧,均为双侧,正常组和模型组给予等量生理盐水滴入。每日3次,连续11 d。

2.3 指标检测

第 11 日治疗结束后,禁食过夜,次日 10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉采集血液标本,按试剂盒说明书进行测定,于酶标仪波长 450 nm 处检测

IL-4、TGF-β1 OD值。

2.4 鼻黏膜病理观察腹主动脉采血后处死大鼠,用10%福尔马林灌洗鼻腔,打开鼻盖骨,充分暴露鼻甲及骨性鼻中隔,剥离完整鼻黏膜,HE染色,光学显微镜下观察。3 统计学方法

采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。实验数据以

x±s — 表示,组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异

有统计学意义。

4 结果4.1 醒鼻温敏凝胶剂对模型大鼠鼻炎症状的影响与正常组比较,模型组大鼠第21、32 日鼻炎症状

评分均显著升高(P<0.01);与模型组比较,第32 日各给药组大鼠鼻炎症状评分均降低,其中醒鼻中剂量

组和阳性对照组作用明显(P<0.01)。结果见表1。—

4.2 醒鼻温敏凝胶剂对模型大鼠血清白细胞介素-4

和转化生长因子-β1含量的影响与正常组比较,模型组大鼠 IL-4、TGF-β1 含量

显著升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠

IL-4、TGF-β1 含量均降低,其中醒鼻中剂量组和阳性

对照组作用明显(P<0.05,P<0.01)。结果见表 2。—

4.3 醒鼻温敏凝胶剂对模型大鼠鼻黏膜病理形态和嗜酸性粒细胞的影响

正常组鼻黏膜血管数量很少,无炎性细胞浸润及血管改变;模型组纤毛脱落、倒伏,小血管增生扩张明显,大量 EOS 浸润,黏膜下腺体数量明显增加,腺体扩张;各给药组病理改变均较模型组改善,EOS浸润减少,且以醒鼻中剂量组和阳性对照组改善明显。见图1。与正常组比较,模型组鼻黏膜EOS 计数

明显增多(P<0.05);与模型组比较,各给药组鼻黏膜 EOS 计数均减少,其中醒鼻中剂量组和阳性对照组

作用明显(P<0.05)。见表 3。 5 讨论本实验采用目前公认较为成熟的AR大鼠模型,通过 OVA 基础致敏及局部激发,成功复制 AR 大鼠模型,应用不同剂量的醒鼻温敏凝胶剂和糖皮质激素类药物雷诺考特分别进行治疗。本实验结果表明,醒鼻温敏凝胶剂可明显改善AR大鼠鼻炎症状,明显降低血清 IL-4、TGF-β1 水平,明显改善鼻黏膜病理,减少 EOS浸润,且以醒鼻中剂量组疗效最优。

AR 属中医“鼻鼽”范畴,外感风邪是鼻鼽的重要诱发因素,随季节变化又可兼夹寒、热、湿等其他邪气。祛风解表通窍法是治疗鼻鼽发作期的首选治疗方法。醒鼻温敏凝胶剂具有疏风解表、醒鼻开窍的功效,可用于鼻鼽的发作期。其中徐长卿性味辛温,功能祛风化湿、止痒止痛,为君药;蝉蜕性味甘寒,功能疏风清热、利咽,有助徐长卿止痒之功和除其过于辛燥之弊,为臣药;牛黄性味甘凉,功能化痰开窍、清热解毒,起佐助之效,为佐药;天然冰片性味辛苦微寒,功能开窍醒神、清热止痛,且能引药上行,为使药。纵观全方,标本兼治,诸药合用,共奏疏风清热、开窍醒鼻之功效。

本实验中,醒鼻温敏凝胶剂并未显示出量效关系,主要原因是醒鼻温敏凝胶剂是复方制备而成的纳米脂质体,分散于新型温度敏感性水性凝胶材料的基质中,接触体表皮肤时能够感应体温而形成凝胶[3]。它能较长时间与鼻黏膜紧密黏附,使药物作用时间延长,增加鼻黏膜对药物的吸收而不损害鼻黏膜,达到将药物集中在鼻部而全身作用降到最小的目的。醒鼻低剂量较中剂量制剂药液更稀薄,药物吸附鼻腔能力不够,在AR大鼠给药中出现药物从鼻腔中倒流。而醒鼻高剂量较中剂量制剂更浓稠,刺激性较强(中药的刺鼻味),在给药时大鼠较抗拒,给药后往往引起鼻腔不适感,出现搔鼻、流涕等症状。相比之下,中剂量吸附力较好,又没有过强的刺激性,故疗效最佳。虽与西药雷诺考特比较,醒鼻温敏凝胶剂并无明显差异,但其无激素类不良反应,更适于儿童使用。

AR 病理特征是以 EOS 浸润为主的慢性炎症, EOS 的生物学功能主要依靠其脱颗粒,人类 EOS 细胞质内约有 200个折光性颗粒,这些颗粒主要包括碱性蛋白、EOS 过氧化酶、EOS 神经毒素等。故 EOS具有细胞毒性,表现在抑制T细胞增殖、促肥大细胞

释放组胺、刺激黏液分泌等[4]。EOS细胞表面有 IL-4、

IL-5 等细胞因子受体,IL-4 通过结合 EOS 表面受体

刺激其分化,增强其黏附性、脱颗粒[5]。IL-4 还可通过刺激巨噬细胞产生的 CCL24 从而诱导嗜酸性粒细

胞在体外迁移和局部浸润[6]。研究显示,EOS可分泌

TGF-β1,促进成纤维细胞生长活化,刺激胶原合成,

参与组织重构[7]。TGF-β1 同时也能调节多种免疫细胞,尤其T淋巴细胞及辅助T淋巴细胞的增殖、分化

及免疫应答等[8]。从本实验可以看出 IL-4、TGF-β1与 EOS表现为同向上升和下降,由此我们推论,Th2细胞分泌 IL-4→结合 EOS 表面受体→刺激其分化,扩增→诱导EOS迁移、局部浸润→分泌TGF-β1→促进成纤维细胞生长活化,参与组织重建和纤维化的过程。EOS分泌细胞因子参与炎症的调节过程,同时,这些细胞因子又反过来促进 EOS 移行、活化和自扩增加,抑制其凋亡,增强代谢,促进炎症发展。如此循环往复,最终引起上皮损害脱落、组织水肿、血管

增生,去鳞状层和上皮细胞下层纤维化等病理变化[9]。综上,醒鼻温敏凝胶剂可能通过下调 IL-4、

TGF-β1等炎症因子水平及减少鼻黏膜EOS浸润而发挥治疗作用。

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(收稿日期:2017-06-08)

(修回日期:2017-08-22;编辑:华强)

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