基于 UPLC-Q-TOF/MS 技术的桑叶化学成分快速识别分析

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - News -

刘金玲 1,2,李文姣 1,2,王韧 1,2,李森 1,2,张雨恬 1,2,周晋 1,2,3,贺福元 1,2,3

1.湖南中医药大学药学院,湖南 长沙 410208;2.中国中医药超分子机理与数理特征化实验室,湖南 长沙 410208;

3.中药成药性与制剂制备湖南省重点实验室,湖南 长沙 410208

摘要:目的 采用超高液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)方法对桑叶的化学成分进行快速分析。方法 采用 ACQUITY UPLC- Q-TOF/MS 联用仪,以乙腈-水(含0.1%甲酸)为流动相梯度洗脱,流速 0.3 mL/min,电喷雾离子源负离子模式采集检测,以 Masslynx4.1 软件分析数据。结果 根据质谱所提供的保留时间、精确相对分子质量及二级质谱裂解碎片信息并结合文献进行分析,共鉴定和推测了桑叶中19 种化学成分。结论 该方法可快速、灵敏、全面地分析桑叶的化学成分,为探讨桑叶的药效物质基础提供依据。关键词:桑叶;超高液相色谱-四级杆-飞行时间质谱;化学成分;黄酮

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.016

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)02-0069-05

Fast Identification Analysis on Chemical Constituents in Mori Folium by Using UPLC-Q-TOF/MS Method

LIU Jin-ling1,2, LI Wen-jiao1,2, WANG Ren1,2, LI Sen1,2, ZHANG Yu-tian1,2, ZHOU Jin1,2,3, HE Fu-yuan1,2,3

1. Pharmacy College, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Laboratory of Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Chracterization for Chinese Materia Medica, Changsha

410208, China; 3. Hunan Key Laboratory of Druggability and Preparation Modification for Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Abstract: Obejective To conduct fast identification analysis on chemical constituents of Mori Folium UPLC-Q-TOF/MS method. Methods ACQUITY UPLC-Q-TOF/MS spectrometer was used, acetonitrile and water (containing 0.1% formic acid) as mobile phase with gradient elution. The flow rate was 0.3 mL/min, with ESI negative ion mode detection, data analysis with Masslynx4.1 software. Results According to the retention time provided by the mass spectrometry, the exact molecular weight and the secondary mass spectrometry were used to analyze the fragments by referring to literature, and 19 chemical constituents of Mori Folium were identified and deduced. Conclusion The method can analyze the chemical constituents of Mori Folium rapidly, sensitively and comprehensively, and provide the basis for the study of the pharmacological basis of Mori Folium.

Keywords: Mori Folium; UPLC-Q-TOF-MS; chemical constituents; flavonoids

桑叶为桑科植物桑 Morus alba L.的干燥叶,分布于全国各地,性寒,味甘、苦,归肺、肝经,具有疏

散风热、清肺润燥、清肝明目功效[1]。桑叶主要含有黄酮类化合物、绿原酸、甾体、三萜类化合物及微量

挥发油等成分[2-4],且黄酮类化合物占桑叶干重的

基金项目:国家自然科学基金(81573691);湖南省重点实验

室建设项目(2016TP1017);湖南省自然科学基金(2017JJ3236);

湖南省教育厅科学研究项目(17B200)通讯作者:贺福元,E-mail:pharmsharking@tom.com

1%~3%,是茎叶中黄酮含量较高的植物。目前已有芦丁、异槲皮苷、绿原酸等成分的研究,为了明确桑叶的药效活性物质基础和作用机制,有必要全面分析桑叶的化学成分。

近年来,超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术结合了超高液相的高分离度和高分辨率质谱的高准确、灵敏性,可快速提供各色谱峰的质谱碎片信息,且可提供化合物的精确分子

质量信息,相对误差<5×10-6,以及二级特征裂解碎片离子信息。即使在缺乏对照品的情况下,也可通过

分析质谱峰的质谱信息或对比文献数据实现复杂体系中化学成分的快速分析,在中药成分体系定性定量

[5-9]分析方面已成为重要的研究手段 。本试验采用UPLC-QTOF/MS 技术对桑叶甲醇提取物进行全成分扫描与快速鉴定,根据其准分子离子峰以及二级碎片离子、文献数据等,鉴定桑叶中的化学成分,为全面有效地建立桑叶的质量标准及现代开发提供支撑。仪器与试药超高效液相色谱串联四级杆/飞行时间质谱(UHPLC-H-CLASS/XEVO G2-XS Qtof)联用仪(美国 Waters 公司),配有 Masslynx4.1 数据处理系统; ACQUITY UPLC BEHC18 色谱柱(美国 Waters 公

司);RE52系列旋转蒸发器(上海雅荣生物设备仪器

有限公司);CP114 型电子精密天平(奥豪斯仪器有限公司);DTD系列超声波清洗机(宁波新芝生物科

技股份有限公司);H1850R离心机(湖南湘仪公司); PINE-TREE 型超纯水制水机(北京湘顺源科技有限公司);移液器(上海大龙医疗设备有限公司)。

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号

110753-201415),芦丁对照品(中国食品药品检定研究院,批号 100080-201409),异槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号 111809-201403);乙腈、甲醇(色谱纯,美国 Tedia 公司),甲酸(色谱纯,美国 Sigma-Aldrich 公司),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。桑叶,产于湖南长沙,经湖南中医药大学石继连副教授鉴定为桑科植物桑 Morus alba L.的干燥叶,低温干燥粉碎后过40目筛备用。2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备分别精密称取绿原酸8.0 mg、芦丁 5.0 mg、异槲皮苷 5.5 mg、紫云英苷 5.0 mg,分别置于 25 mL容量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻,进样前稀释至1~

100 ng/mL 并过 0.22 μm微孔滤膜,备用。

2

2.2供试品溶液的制备称取适量桑叶样品,低温干燥粉碎后过40 目筛,精密称定样品粉末1 g,置具塞锥形瓶中,加50%甲醇 90 mL,密塞,精密称定,超声提取(功率100 W,频率 40 kHz)1h,取出后放冷至室温,再次精密称定,加50%甲醇补足减失的质量,12 000 r/min 高速离心 15 min,取上清液,用 0.22 —m微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。

2.3 液质联用条件

2.3.1 色谱条件

采用 Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱

(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流动相 A为 0.1%甲酸水溶液、B为乙腈,梯度洗脱(0~5 min,10%~16%B;

5~9 min,16%~24%B;9~14 min,24%~76%B;

14~20 min,76%~100%B;20~25 min,100%~

10%B);进样量 1 μL;流速 0.3 mL/min;柱温 30 ℃。

2.3.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI),用负离子模式采集数据,使用高纯氮气作为雾化器和辅助气,氩气作为碰撞气,离子源温度为 120 ℃,去溶剂化温度 300 ℃,锥孔气流 50 L/h,去溶剂化气流 800 L/h,喷雾电压

-4500 V,温度 600 ℃,碰撞电压 30 V,校正离子

554.262 0 m/z,质量数扫描范围 m/z 100~1200,数据采集时间 25 min。

2.4 桑叶中化学成分确认

按“2.3”项下条件对 50%甲醇提取桑叶药材成分进行定性分析,桑叶样品在ESI-模式下获得了良好的响应值,其(-)ESI-MS 的质谱总离子流图(TIC)见图 1。采用 Masslynx4.1 软件分析其中各化学成分的保留时间及其质谱信息,并结合其分子离子峰与对照品、文献报道的数据进行对比,再对其中的化学成分进行辨别,从而鉴定出桑叶提取物中19个化合物,鉴定结果见表1。

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