干旱胁迫对成药期党参生理特性的影响

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王惠珍 1,2,陆国弟 1,陈红刚 1,2,崔治家 1,杜弢 1,2,王亚丽 2

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地,甘肃 兰州 730000摘要:目的 研究成药期党参在干旱胁迫下的生理特性变化,揭示党参响应干旱胁迫的生理机制。方法 采用盆栽控水试验,设置正常供水、轻度胁迫、中度胁迫和重度胁迫4个水分处理,通过测定党参叶片相对含水量、细胞膜透性、渗透调节物质含量、抗氧化酶活性等指标,研究干旱胁迫对党参生理特性的影响。结果 随干旱胁迫程度增加,党参叶绿素a、叶绿素总含量和叶片相对含水量呈逐渐降低趋势,叶绿素b无明显变化;电导率呈先增加后降低的趋势,丙二醛含量呈先增加后降低再增加的趋势,超氧阴离子产生速率无明显变化;过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性呈逐渐增加趋势,超氧化物歧化酶无明显变化;脯氨酸含量呈先增加后降低的趋势,可溶性糖呈降低趋势,可溶性蛋白无明显变化。结论 干旱胁迫下,党参通过增加脯氨酸含量调控细胞渗透势,同时提高抗氧化酶POD 和 CAT活性,减轻膜脂过氧化产物对细胞的伤害。关键词:党参;干旱胁迫;膜透性;保护酶;渗透调节物质

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.016

中图分类号:R282.2 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)03-0072-05

Effects of Drought Stress on Physiological Characteristics of Codonopsis Radix

WANG Hui-zhen1,2, LU Guo-di1, CHEN Hong-gang1,2, CUI Zhi-jia1, DU Tao1,2, WANG Ya-li2

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;

2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality and Standard, Lanzhou 730000, China Abstract: Objective To study the physiological characteristics of Codonopsis Radix under drought stress; To reveal the physiological mechanism of Codonopsis Radix in response to drought stress. Methods Method of pot experiment was used to set up 4 water treatments: normal water supply, mild stress, moderate stress and severe stress. Through the determination of leaf relative water content, cell membrane permeability, osmotic adjustment contents and protective enzyme activity, the effects of drought stress on physiological characteristics of Codonopsis Radix were studied. Results With the drought stress increased, the chlorophyll a, total chlorophyll content and leaf relative water content of Codonopsis Radix decreased, but chlorophyll b had no obvious change; The conductivity increased first and then decreased; MDA contents increased first and then decreased and then increased; There was no significant change in the rate of superoxide anion production; POD and CAT activity increased; SOD had no significant change; The proline content increased first and then decreased; soluble sugar decreased; soluble protein had no significant change. Conclusion Under the condition of drought stress, by increasing the content of proline to regulate cell osmotic potential, Codonopsis Radixcan increase the antioxidant enzyme activity to reduce membrane lipid peroxidation damage to cells.

Keywords: Codonopsis Radix; drought stress; membrane permeability; protective enzyme; osmotic adjustment substance

我国干旱及半干旱地区面积广,非干旱地区作物在生长季节也会发生不同程度的干旱。据不完全统计,我国每年由干旱给农业造成的损失相当于其他所

基金项目:国家自然科学基金(81760683);甘肃省自然科学

基金(145RJZA031);甘肃省中药质量与标准研究重点实验室

培育基地开放基金(ZYZL16-004)

有环境因子的总和[1]。目前已在柴胡、蒲公英、金钗石斛、忍冬、文冠果等药用植物上进行了抗旱特性和

耐旱机制研究[2-6]。

党参 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.为桔梗科多年生草本植物,以干燥根入药,具补中益气、健脾益肺功效,用于脾肺气虚、食少倦怠、咳嗽虚喘、心悸气短、内热消渴等。甘肃渭源、陇西等地是党参

主产区。多年种植经验得出,党参具有耐旱性,但其耐旱机制鲜见报道。因此,本研究通过盆栽控水试验,探讨干旱胁迫下党参生理特性变化,为深入研究党参抗旱或耐旱机制奠定基础,也为半干旱地区党参规范化栽培提供依据。

1 材料试验种苗为渭源县清源镇药农自育一年生党参幼苗,带有饱满越冬芽,种苗根长 16.0~18.0 cm、根头直径 2.5~3.0 mm,甘肃中医药大学杜弢教授鉴定为党参 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.。

试验选用盆口直径25 cm、高 30 cm的塑料水桶,底部均匀打孔以防积水烂根。土壤为沙壤土,pH 8.12,有机质 0.32%,全氮 0.10%,速效磷 53.2 mg/kg,速效钾 147.32 mg/kg。

台式低温高速离心机(Eppendorf 5418,德国艾本德股份公司),超纯水分离系统(Molecular,北京

科思佳科技有限责任公司),紫外分光光度计(752N型,上海精科实业有限公司),电导率测定仪

(DDS-307,杭州汇尔仪器设备有限公司)。

2 方法

2.1 盆栽试验于渭源县清源镇刘家河村实施盆栽试验。每盆装土 19 kg,于 2016 年 4 月 5日移栽,每盆4株,正常

供水,直至出苗(4月 25 日)后 15 d(5 月 10 日),选取长势一致的植株作为供试材料,进行水分处理。

采用单因素完全随机设计,根据党参产区渭源县

2014 年和 2015 年降雨量[7]及党参生长发育情况,以全年降雨量 480 mm为基础,减去根茎类药材农闲期降雨量(约80 mm),分别设置 360 mm(轻度胁迫)、

320 mm(中度胁迫)和 280 mm(重度胁迫)3个干旱处理,以 400 mm灌溉量为对照(CK),各 10 次重复。从5 月 10日开始至收获按180 d计算,每3 d灌溉 1次,灌溉量换算结果见表1。

2.2 测定指标

2.2.1 叶绿素含量采用80%丙酮提取,分光光度计比色测定,以mg/g表示。

2.2.2叶片相对含水量取待测叶片,流水冲洗,去离子水冲洗后,滤纸吸干表面浮水,称鲜重(Wf),浸入蒸馏水中10 h,取出,吸干表面浮水,称饱和鲜重(Wt),置烘箱105 ℃杀青 15 min,80 ℃恒温烘至恒重,称干重(Wd),计算相对含水量(RWC)。RWC(%)=(Wf-Wd)÷

(Wt-Wd)×100%。

2.2.3 膜脂过氧化相关指标①细胞膜透性:采用电导仪测定。细胞膜透

性(%)=L1/L2×100%。式中,L1 为各处理叶片杀

死前外渗液的电导值,L2为各处理叶片杀死后外渗液的电导值。②超氧阴离子产生速率:采用羟胺氧化法测定。取 0.2 g植物材料,加入 0.05 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.8)1.0 mL 于冰浴研磨,12 000 r/min 离心

15 min,取上清液 0.5 mL,加入磷酸缓冲液 0.5 mL和 10 mmol/L 盐酸羟胺1 mL,25 ℃静置1h,加入

17 mmol/L 对氨基苯磺酸 1 mL 和 7 mmol/L α-萘胺

1 mL,25 ℃静置 20 min,测其 530 nm波长处吸光度(OD 值),根据标准曲线换算,以 nmol/(min•g)表示。③丙二醛:采用硫代巴比妥酸法。取 0.5 g 样品,加入2 mL预冷的 0.05 mol/L pH 7.8 磷酸缓冲液,加入少量石英砂,在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆,转移到5 mL刻度离心试管,将研钵用缓冲液洗净,清洗液移入离心管中,最后用缓冲液定容至 5 mL。在 4500 r/min 离心 10 min。吸取 2 mL上清液于刻度试管中,加入含0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3 mL,于沸水浴上加热10 min,迅速冷却,4500 r/min离心 10 min,取上清液,以蒸馏水为对照,于532、

600 nm波长处测定吸光度,以 µmol/g 表示。

2.2.4 渗透调节物质含量①脯氨酸:采用酸性茚三酮法,以 µg/g 表示; ②可溶性蛋白:采用考马斯亮蓝 G-250 法,以 µg/g表示;③可溶性糖:采用蒽酮比色法,以µg/g 表示。

2.2.5 抗氧化酶活性①超氧化物歧化酶(SOD)活性:采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法,以 A560条件下抑制 NBT 光化还原50%的酶用量为 1 个酶活性单位(U/g);②过氧化物酶(POD)活性:采用愈创木酚法,以每分钟内

A470变化 0.01 为1 个酶活性单位[U/(g•min)];③过氧化氢酶(CAT)活性:采用紫外吸收法,以每分钟

A240变化 0.01 为 1 个酶活性单位[U/(g•min)]。

2.3 统计学方法

采用Excel 2007和SPSS 17.0统计软件进行分析。数据用x±s表示,采用新复极差法进行处理间的比较。

P<0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果3.1 干旱胁迫对党参叶绿素含量的影响在持续控水条件下,干旱对党参叶绿素产生显著影响,随干旱胁迫增强呈降低趋势。轻度胁迫下,叶绿素a、叶绿素 a/b值和叶绿素总含量与CK比较差异

均无统计学意义(P>0.05);中度、重度胁迫下,叶绿素 a 较 CK分别下降 17.2%、27.7%(P<0.05),叶绿素总含量较CK分别下降 13.7%、20.0%(P<0.05);各干旱处理下叶绿素b含量与CK比较差异无统计学

意义(P>0.05)。结果见表 2。

— 轻度胁迫

中度胁迫

重度胁迫

注:同列不同小写字母表示

3.2干旱胁迫对党参叶片相对含水量的影响叶片水分是维持植物体正常生理作用的基础。成药期党参叶片相对含水量随干旱胁迫程度的增加呈下降趋势,轻度、中度、重度胁迫分别较 CK 降低

7.3%、7.3%、21.25%,仅重度胁迫与 CK比较差异有

统计学意义(P<0.05)。结果见图 1。

3.3干旱胁迫对党参叶片细胞膜透性的影响干旱胁迫下,植物体细胞膜受到损伤,细胞膜透性增加,细胞内含物外渗,电导率增大。细胞膜透性的大小可以用相对电导率来衡量,其值越大,表明电解质的渗漏量越多,细胞膜受伤害程度越重。在持续控水条件下,轻度胁迫的细胞膜透性较 CK 增加

4.5%,但差异无统计学意义(P>0.05),中度胁迫较CK 增加 14.2%(P<0.05),而重度胁迫下的细胞膜透性略低于CK。结果见图2。

3.4 干旱胁迫对党参叶片超氧阴离子产生速率和丙二醛含量的影响

在持续控水条件下,党参叶片超氧阴离子产生速率随干旱程度的增强呈先增加后降低的变化趋势(见图3),轻度、中度、重度胁迫党参超氧阴离子产生速率分别较CK升高 16.5%、10.4%、11.3%(P<0.05),

3 个干旱胁迫处理间比较差异无统计学意义(P>

0.05);党参叶片 MDA含量随干旱胁迫程度增强呈先增加后降低再增加的变化趋势(见图 4),重度胁迫MDA含量较CK增加 25.8%(P<0.05),轻度、中度胁迫与CK 比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.5干旱胁迫对党参渗透调节物质的影响在遇到逆境条件时,植物会通过增加体内渗透调节物质含量来维持渗透压,避免细胞受到伤害。脯氨酸是重要渗透调节物质。轻度和重度干旱胁迫党参脯氨酸含量均低于 CK,但差异无统计学意义( P>

0.05);中度干旱胁迫较 CK增加 20.7%(P<0.05)。此结果与细胞膜透性的变化趋势一致。可溶性糖随干旱程度增加呈降低趋势,可溶性蛋白无明显变化。从

3 种渗透调节物质的总积累量分析(依次为 52.98、

51.94、58.27、47.04 —g/g),中度胁迫显著高于 CK,轻度胁迫与 CK 间无明显差异,重度胁迫显著低于CK。结果见图5。

— 3.6 干旱胁迫对党参抗氧化酶活性的影响通过测定持续控水后党参叶片抗氧化酶活性可知,随干旱胁迫程度增加,POD、CAT 和 SOD 活性均呈不同程度的增加趋势(见图6~图 8)。轻度、中度胁迫党参叶片 POD 活性与 CK 无明显差异,重度胁迫较 CK 增加 19.2%(P<0.05);轻度、中度、重度胁迫党参叶片 CAT 活性分别较 CK 增加 14.4%、19.3%、38.5%(P<0.05),轻度和中度胁迫无明显差异;各处理间SOD活性无明显差异。

或破坏植物的正常生长[8],并通过抑制叶片伸展等使

光合作用受到抑制,进一步影响植物的生长发育[9]。干旱使核糖体的形成受到影响,从而抑制了叶绿体层中捕光 Chla/b-Pro 复合体的合成,阻碍了叶绿素积累,且叶绿素a对活性氧的反应较叶绿素b敏感,其破坏程度往往大于叶绿素 b,导致叶绿素总含量和叶绿素 a/b 比值下降,其下降程度与抗旱性呈极显著

负相关[10]。本研究结果显示,随着干旱程度的加重,党参叶绿素 a、a/b值和总含量均下降,但降幅较小,且轻度干旱胁迫并未阻碍党参叶绿素合成,说明党参的耐旱性较强。

植物相对含水量常被用来衡量干旱胁迫程度。已有研究发现,干旱胁迫后,大丽花和杠柳等种子植物的叶片相对含水量仍在 60%以上[11-12],金钗石斛在

75%以上[6],细叶小羽藓在 8.36%[3],表明不同植物抵御干旱胁迫的能力不同。本研究结果显示,党参叶片相对含水量随干旱程度的增加而降低,但仍可维持在

67.9%以上,尤其是在轻度和中度干旱胁迫下,党参叶片相对含水量稳定在CK水平左右,以维持正常的生理代谢。说明党参与抗旱植物杠柳、金钗石斛等相

似,具有较强的抗旱性。

细胞膜透性反映膜的稳定性。MDA 具有很强的毒性,膜质过氧化程度可用MDA含量表示,作为植物受胁迫伤害程度的重要指标。本试验结果表明,轻度胁迫下党参叶片细胞膜透性和MDA含量均维持在较低水平;中度胁迫时,膜透性显著增加,而 MDA含量有所下降;重度胁迫下,MDA 含量开始增加,但与鞑靼忍冬(MDA 增加 32%以上)[7]相比,党参叶片MDA含量增幅较小,说明党参耐旱性较强。本研究结果还显示,干旱胁迫下党参叶片超氧阴离子产生速率先降低后增加,且轻度、中度和重度胁迫的超氧阴离子产生速率在 0.128~0.134 µmol/(min•g)范围内,说明党参具有较强的耐旱性。

渗透调节是植物响应水分胁迫的一个重要生理保护机制,脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白作为重要的渗透调节物质,在干旱胁迫下大量增加是植物的第

一生理反应[13]。干旱条件下渗透调节物质的积累有助于细胞原生质与环境渗透平衡,防止水分散失,缓解

逆境对植物的危害[14]。本研究结果表明,轻度胁迫下,党参叶片脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均无明显变化,说明轻度干旱胁迫未对党参细胞构成危害;中度胁迫下,脯氨酸含量显著增加,可溶性糖和可溶性蛋白无明显变化,说明脯氨酸是党参响应干旱的首

要渗透调节物质,这与对甘草[15]、银柴胡[2]的研究结果一致;重度胁迫下,脯氨酸含量有所下降,这与对

细叶小羽藓[3]、蒲公英[4]的研究结果一致。因此,党参在遇到干旱胁迫时,首先积累脯氨酸含量维持细胞渗透压,但重度干旱胁迫下党参脯氨酸含量降低是否与体内代谢紊乱有关,还有待进一步研究。

植物在长期进化过程中,为了抵御各种逆境条件,最大限度减少对自身的伤害,形成了各种保护机制。SOD、POD、CAT三者协同作用,防御活性氧或

其他过氧化自由基对细胞膜系统的伤害[16]。本研究结果表明,随着干旱胁迫程度的增加,CAT 和 POD 活性呈增加趋势,说明党参在干旱胁迫条件下,可以通过增加抗氧化酶活性,迅速清除体内膜脂过氧化产生的活性氧自由基和 MDA,增强抗性。这与对蒲公英

的研究结果[4]一致。综上所述,在轻度干旱胁迫下,党参各生理指标均处于正常水平,说明党参具有耐旱性;在中度和重度干旱胁迫下,党参体内渗透调节物质和抗氧化酶活性迅速增加,说明党参具有较强的抗旱能力。因此,从党参生理特性变化的角度考虑,农耕时期降雨量≥ 320 mm的干旱地区均可进行党参规范化种植。

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(收稿日期:2017-05-04)

(修回日期:2017-05-23;编辑:陈静)

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