益胃消瘀颗粒质量标准研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - News -

刘霞,徐冲,吴文辉,郭小红,孙全,田锋亮

重庆市中医院,重庆 400021

摘要:目的 建立益胃消瘀颗粒的质量标准。方法 采用薄层色谱法(TLC)定性鉴别白术、当归和石斛,采用 HPLC同时测定三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1及人参皂苷Re的含量。结果 TLC斑点清晰,阴性对照无干扰。三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Re 分别在 0.067 2~0.672 µg(r=

0.999 6)、0.501 2~5.012 µg(r=0.999 6)、0.326 5~3.265 µg(r=0.999 6)、0.098 3~0.983 µg(r=0.999 7)范围内线性关系良好,平均回收率分别为 96.32%、96.45%、101.23%、97.89%,RSD 分别为 1.3%、1.5%、1.7%、

1.7%。结论 该方法准确可靠,重复性好,可用于益胃消瘀颗粒的质量控制。关键词:益胃消瘀颗粒;质量标准;三七皂苷R1;人参皂苷 Rg1;人参皂苷 Rb1;人参皂苷 Re

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.017

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)03-0077-04

Study on Quality Standard of Yiwei Xiaoyu Granules

LIU Xia, XU Chong, WU Wen-hui, GUO Xiao-hong, SUN Quan, TIAN Feng-liang

Chongqing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400021, China

Abstract: Objective To establish the quality standard for Yiwei Xiaoyu Granules. Methods TLC was used for the qualitative analyses of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma, Angelicae Sinensis Radix and Dendrobii Caulis; HPLC was applied to determine the contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re. Results The TLC spots were clear and free from negative interference. Notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re showed good linear relationships within the ranges of 0.067 2–0.672 µg (r=0.999 6), 0.501 2–5.012 µg (r=0.999 6), 0.326 5–3.265 µg (r=0.999 6), 0.098 3–0.983 µg (r=0.999 7), whose average recoveries were 96.32% (RSD=1.3%), 96.45% (RSD=1.5%), 101.23% (RSD=1.7%), and 97.89% (RSD=1.7%), respectively. Conclusion This method is accurate, reliable, and reproducible, which can be used for the quality control of Yiwei Xiaoyu Granules.

Keywords: Yiwei Xiaoyu Granules; quality standard; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; ginsenoside Re

益胃消瘀颗粒由红参、三七、娑罗子、白术、当归、石斛等 10 味中药组成,具有温脾益气养阴、疏肝和胃化瘀功效,临床主要用于治疗胃脘痞满、胃中嘈杂或隐痛、食纳减少等脾阳胃阴不足、气滞夹瘀证的慢性浅表性胃炎及萎缩性胃炎伴有肠上皮化生、异型增生者[1]。该方原以汤剂形式在本院应用10 余年,临床疗效确切且安全可靠,现拟将汤剂改成颗粒剂,以更好地适应患者需求。

本课题组前期已建立了益胃消瘀颗粒的制备工艺:红参、三七粉碎成细粉,过筛,其余娑罗子等

基金项目:重庆市科技研发平台项目(cstc2015pt-nsjg10003);

重庆市基本科研业务费计划项目(cstc2015jbky330025004)

通讯作者:田锋亮,E-mail:17325728@qq.com

8味药加水煎煮,煎液过滤,合并滤液,浓缩至适量,与上述粉末混匀,干燥,粉碎成细粉,加糊精适量,制成颗粒,干燥,混匀,包装,即得。为了更好地控制益胃消瘀颗粒的质量,保证临床用药安全有效,需建立益胃消瘀颗粒的质量标准。方中红参、三七共为

君药,以粉末形式加入制粒,2015年版《中华人民共和国药典》(一部)以人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1和人参皂苷 Re 为指标性成分对红参进行定量评价,以人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1、三七皂苷 R1为指标性成分对三七进行定量评价,故本研究采用HPLC 同时测定益胃消瘀颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re多指标性成分,采用TLC对方中白术、当归、石斛进行定性鉴别,控制益胃消瘀颗粒的质量。

仪器与试药

Agillent-1260 高效液相色谱仪(美国 Agillent公司),SymmetryShieldTM RP18 色谱柱(5 µm,

250 mm×4.6 mm),KQ3200E 型超声波清洗器(昆山

市超声仪器有限公司),JA3003J 型电子密度天平

(上海舜宇恒平科学仪器有限公司),AE-200型电子天平(天津 METTLER 公司),智能恒温电热套(ZNHW-Ⅱ型,河南爱博特公司)。

益胃消瘀颗粒(批号 160321、160322、160323),重庆市中医院制剂室提供。阿魏酸、石斛酚、三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Re对照品(批号分别为 110773-201313、111875-201202、

0745-200006、0703-200118、110704-201124、754-200115),白术对照药材(批号 0925-200005),中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 白术

取样品(批号 160321、160322、160323)10 g,加水煎煮 2 h,过滤,滤液用水饱和的正丁醇振摇提取 3次,每次 20 mL,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇 1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取白术对照药材 1 g,同法制成对照药材溶液。按处方称取除白术外的药材,按制剂工艺制得缺白术阴性制剂,同法制成阴性对照溶液。吸取上述5种溶液各 10 µL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-丙酮-甲酸

(9.5∶0.5∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,在

紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照无干扰。

2.1.2 当归

取样品(批号 160321、160322、160323)10 g,加1%碳酸氢钠溶液 50 mL,超声处理 10 min,离心,取上清液,用稀盐酸调节pH 值至2〜3,用乙醚振摇提取 2次,每次 20 mL,合并乙醚液,挥干,残渣加甲醇 l mL 使溶解,作为供试品溶液。另取当归对照药材1g,加1%碳酸氢钠溶液 50 mL,同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品,加甲醇制成每 l mL含 l mg的溶液,作为对照品溶液。按处方称取除当归外的药材,按制剂工艺制得缺当归阴性制剂,同法制成阴性对照溶液。吸取上述6种溶液各 10 µL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-甲醇-冰醋酸(10∶

1∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫 酸乙醇溶液,在 105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。

2.1.3 石斛

取样品(批号 160321、160322、160323)10 g,加甲醇 50 mL,超声处理 30 min,过滤,滤液蒸干,残渣加水 20 mL使溶解,用三氯甲烷振摇提取2次,每次 20 mL,合并三氯甲烷液,回收溶剂至干,残渣加三氯甲烷1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取石斛酚对照品,加三氯甲烷制成每1 mL 含 0.4 mg 的溶液,作为对照品溶液。按处方称取除石斛外的药材,按制剂工艺制得缺石斛阴性制剂,同法制成阴性对照溶液。吸取上述5种溶液各 10 µL,分别点于同一硅胶 GF254 薄层板上,以石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙

酯-甲酸(12∶6∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以 10%硫酸乙醇溶液,在 105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

采用 Waters C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 µm);

流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱

(0~25 min,81%B;25~50 min,81%→79%B;50~

55 min,79%→69%B;55~80 min,69%B);流速:

1.0 mL/min;检测波长:203 nm;柱温:30 ℃;进样

量:5 µL。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷

Rb1和人参皂苷Re对照品适量,用甲醇配制成浓度分别为 0.067 2、0.501 2、0.326 5、0.098 3 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品约 15 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入水饱和正丁醇50 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率 250 W,频率50 kHz)1h,放冷,再称定质量,用水饱和正丁醇溶液补足减失的质量,过滤,精密量取续滤液25 mL,置分液漏斗中,加氨试液洗涤 2次,每次 15 mL,取正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇使溶解,转移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备按处方量并以相同制剂工艺制备缺红参和三七的阴性样品,称取约15 g,按“2.2.3”项下方法制备,即得。

2.2.5系统适用性试验取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,按

“2.2.1”项下色谱条件测定。结果所测成分色谱峰与样品中其他组分色谱峰基线分离,阴性无干扰,见图1。

2.2.6 线性关系考察

精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液 1、2、4、

8、10 µL,按“2.2.1”项下条件测定,以进样量(µg) 为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得各成分回归方程。三七皂苷 R1:Y=278.810 5X-1.185 6

(r=0.999 6);人参皂苷 Rg1:Y=188.312 6X+1.385 2

(r=0.999 6);人参皂苷 Rb1:Y=243.501 8X+0.715 1

(r=0.999 6);人参皂苷 Re:Y=207.456 5X+2.385 7

(r=0.999 7)。4 种成分依次在 0.067 2~0.672 µg、

0.501 2~5.012 µg、0.326 5~3.265 µg、0.098 3~0.983 µg范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液 5 µL,重复进样6次,结果三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷 Re 的 RSD 分别为 1.6%、1.4%、

1.5%、0.9%,表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验称取同一批益胃消瘀颗粒6份,每份约15 g,按

“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件测定,结果三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Re 的 RSD 分别为 1.7%、1.2%、

1.0%、1.5%,表明本方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验称取益胃消瘀颗粒约15 g,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,于 0、2、4、8、12 h 按“2.2.1”项下色谱条件测定,结果三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、人参皂苷 Re 的 RSD 分别为 1.8%、

1.0%、0.9%、1.3%,表明供试品溶液在 12 h 内基本稳定。

2.2.10 加样回收率试验精密称取已知含量的样品(批号 160321)1.0 g,共 24 份,分别精密加入“2.2.2”项下混合对照品溶

液适量,同时按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,

按“2.2.1”项下色谱条件测定,计算加样回收率,结果见表1,表明本方法回收率良好。

2.2.11 样品含量测定

取 3批样品,按上述方法测定,结果见表2。 3 讨论白术的化学成分主要为挥发油,对白术及其制剂的 TLC 鉴别主要是对其挥发油类成分的鉴别[2]103。目前益胃消瘀颗粒的制备工艺沿用传统方法,通过水煎煮制成颗粒剂,故需对白术的水溶性成分进行鉴别。

本试验曾分别采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.2)、

三氯甲烷-丙酮-甲酸(9.5∶0.5∶0.5)展开系统[3-4],

结果表明,以三氯甲烷-丙酮-甲酸(9.5∶0.5∶0.5)为展开剂,紫外光 365 nm波长下检视,样品斑点清晰,分离效果较好。

当归的主要化学成分包括挥发油和水溶性成分,其中阿魏酸是当归水溶性部分主要有效成分之一。本

试验分别考察了苯-甲醇-冰醋酸(10∶1∶0.5)、正己

烷-三氯甲烷-冰醋酸(6∶4∶1)、甲苯-乙酸乙酯-甲

酸(9∶1∶1)展开系统[2]133[5-6],发现以苯-甲醇-甲酸

(10∶1∶0.5)为展开系统时分离度高,斑点清晰。经本院药检室鉴定,益胃消瘀颗粒所使用的石斛为黄草石斛。对其TLC鉴别,试用 2015 年版《中华人民共和国药典》(一部)石斛项下流苏石斛等薄层

色谱鉴别方法,以石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙酯

(3∶2)为展开剂,但供试品展开效果不理想,虽然显色后可见石斛酚的斑点,但斑点不够圆整。故又分

别考察了石油醚(60~90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(12∶

6∶1)、环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(1∶2∶3)展开

系统[2]92[7]。结果表明,以石油醚(60~90 ℃)-乙酸

乙酯-甲酸(12∶6∶1)为展开剂时,阴性无干扰,斑点圆整清晰,分离度较好。

益胃消瘀颗粒处方中,三七和红参共为君药,药理研究表明,红参的主要有效成分人参皂苷类具有抑

制胃癌细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用[8-10],三七及其主要有效成分三七皂苷 R1 能在一定程度上减轻胃缺血-再灌注黏膜损伤,且三七能逆转大鼠胃黏

膜上皮异型增生和肠上皮化生等[11-13],故本试验选择三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1和人参皂苷Re作为益胃消瘀颗粒含量测定指标。在Waters C18

色谱柱,乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱

(0~25 min,81%B;25~50 min,81%→79%B;50~

55 min,79%→69%B;55~80 min,69%B),203 nm

波长条件下,4 个指标成分分离度良好,且阴性对照

未见干扰。在甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相时,峰2和峰 3不易分离,且柱压相对较高。

综上所述,本试验所建立的白术、当归、石斛的TLC特征斑点清晰,阴性样品溶液均无干扰,且分离度好;三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1和人参皂苷 Re 的 HPLC 含量测定方法可靠易行,专属性好,可为益胃消瘀颗粒质量控制提供依据。

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(收稿日期:2017-05-31)

(修回日期:2017-06-16;编辑:陈静)

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