HepG2.2.15细胞对同时包载丁香苦苷和羟基酪醇纳米粒的摄取机制研究

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管庆霞,李云行,吕邵娃,孙佳琳,张亮,封文静,王利萍,李永吉

黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040

摘要:目的 考察 HepG2.2.15 细胞对同时包载丁香苦苷和羟基酪醇纳米粒(nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol,SH-NPs)的摄取机制。方法 采用沉淀法制备SH-NPs,以异硫氰酸荧光素为荧光标记物,采用流式细胞仪研究 HepG2.2.15 细胞对 SH-NPs 的摄取机制。结果 秋水仙素为抑制剂,孵育时间在 0.5~24 h范围内,阳性细胞百分数由1.9%增加到 56.4%;药物浓度为 125、250、500 µg/mL 时,阳性细胞百分数分别为 4.9%、3.4%、3.9%。氯喹为抑制剂,孵育时间在 0.5~24 h范围内,阳性细胞百分数由

7.4%增加到 55.4%;药物浓度为 125、250、500 µg/mL时,阳性细胞百分数分别为 19.5%、22.5%、27.6%。结论 秋水仙素与氯喹对 HepG2.2.15 细胞摄取有抑制作用,且 HepG2.2.15 细胞对 SH-NPs的摄取与药物浓度、孵育时间呈正相关,推断 HepG2.2.15 细胞对 SH-NPs细胞的摄取机制为非特异性吸附内吞。

关键词:丁香苦苷;羟基酪醇;聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物纳米粒;HepG2.2.15细胞;摄取机制

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.018

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)03-0081-05

Study on Cellular Uptake Mechanism of HepG2.2.15 Cells to Nanoparticles Co-loaded with Syringopicroside and Hydroxytyrosol

GUAN Qing-xia, LI Yun-xing, LV Shao-wa, SUN Jia-lin, ZHANG Liang, FENG Wen-jing, WANG Li-ping, LI Yong-ji

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

Abstract: Objective To investigate the uptake mechanism of HepG2.2.15 cells to the nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol (SH-NPs). Methods The nanoparticles were prepared by using a nanoprecipitation method with mPEG-PLGA as nano-carrier co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. The uptake mechanism of HepG2.2.15 cells to SH-NPs was studied by fluorescence microscopy and flow cytometry using fluoresceineisothiocyanate (FITC) as a fluorescent marker. Results With colchicine as the inhibitor, the incubation time ranged from 0.5 to 24 h, the percentage of positive cells increased from 1.9% to 56.4%; When the drug concentration was 125, 250 µg/mL and 500 µg/mL, the positive cell percentages were 4.9%, 3.4% and 3.9%. With chloroquine as the inhibitor; the incubation time ranged from 0.5 to 24 h, the percentage of positive cells increased from 7.4% to 55.4%; When the drug concentration was 125, 250 and 500 µg/mL, the percentage of positive cells was 19.5%, 22.5% and 27.6%. Conclusion Colchicine and chloroquine have an inhibitory effect on HepG2.2.15 cells uptake, and the uptake of SH-NPs in HepG2.2.15 cells was positively correlated with drug concentration and incubation time. It can be concluded that the uptake mechanism of HepG2.2.15 cells to SH-NPs was nonspecific adsorption endocytosis.

Keywords: syringopicroside; hydroxytyrosol; mPEG-PLGA nanoparticles; HepG2.2.15 cells; uptake mechanism

基金项目:国家自然科学基金面上项目(81274091);黑龙江

省自然科学基金面上项目(H2016076);黑龙江中医药中青年

科技攻关项目(ZQG-039);黑龙江省教育厅科学技术研究项目

(12531624);哈尔滨市应用技术研究与开发项目(2017RAQXJ090)

通讯作者:李永吉,E-mail:Liyongji2009@163.com

丁香苦苷( syringopicroside )和羟基酪醇(hydroxytyrosol)是木犀科植物洋丁香、朝鲜丁香或紫丁香干燥叶中的活性物质,二者体内代谢迅速,稳定性及肝靶向性差,常规给药途径不利于药效的发挥。近年来,由于肝癌发病率逐渐增高,因此,开发提高丁香苦苷和羟基酪醇靶向于肝细胞的新型递药

系统是目前亟需解决的问题。

中药纳米递药系统不仅具有较强的靶向性,而且在生物利用度和缓释功能方面也具有较大优势。研究发现,纳米粒(NPs)的表面用聚乙二醇(PEG)等亲水性的高分子材料修饰后,能够形成一层水化保护膜,减少巨噬细胞对纳米粒的识别和吞噬,同时能延长纳米粒血液循环时间,从而产生缓释作用,提高生物利用度,降低毒副作用,为药物输送提供了新途

径[1-2]。本课题组将二者制备成聚乙二醇-聚乳酸乙醇酸共聚物(monomethoxy polyethylene glycol-poly lactideco-glycolide,mPEG-PLGA)纳米递药系统,并且于前期进行了关于同时包载丁香苦苷和羟基酪醇纳米粒(nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol,SH-NPs)的制剂性状研究,结果表明,SH-NPs 总包封率为(32.38±2.76)%,总药物

负荷为(12.01±0.42)%,粒径为(91.70±2.11)nm,多分散指数为 0.22±0.01,通过透射电子显微镜观察, SH-NPs 颗粒形态圆整,均匀分布,且对肝脏具有较

强的靶向性[3],同时,经过 HepG2.2.15 细胞对 SH-NPs摄取研究,发现SH-NPs能够被HepG2.2.15细胞摄取,在此基础上进一步进行细胞摄取机制的研究,选择秋水仙素和氯喹为内吞抑制剂,以异硫氰酸荧光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)为荧光标记物,用纳米沉淀法制备 SH-NPs,以 HepG2.2.15 细胞为模型细胞,借助流式细胞仪研究 HepG2.2.15 细胞对SH-NPs 的细胞摄取机制,为存在肝靶向性差、稳定性差、半衰期短等缺陷的药物的纳米化提供新思路。1 细胞、仪器与试药

HepG2.2.15 细胞株(上海博谷公司),空白 NPs (自制)。

HFsafe-1200 型超净工作台(Heal Force 公司), HZQ-C型空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发

有限公司),H2050R型离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司),液氮罐(成都金凤有限公司),细胞培养板、细胞培养瓶(Corning),BD Accuri C6型流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company),RPMI-1640液体培养基(美国 Hyclone 公司),10%优级胎牛血清(美国 Hyclone 公司),胰蛋白酶(美国 Hyclone 公司),磷酸盐缓冲液(PBS,武汉博士德公司),双抗(青霉素/链霉素,华北制药厂),胰蛋白酶(美国Hyclone 公司),碘化丙啶(PI,南京凯基公司),SH-NPs冻干粉(自制),FITC(Sigma 公司,批号 20130608),秋水仙素(美国 Acros organics 公司),氯喹(美国Acros organics 公司)。

2 方法与结果

2.1 SH-NPs 与 FITC 标记的 SH-NPs 制备

[4]采用纳米沉淀法制备纳米粒 ,精密称量

10%mPEG-PLGA 共聚物 20 mg,分散于 10 mL丙酮中,超声使其溶解,形成有机相。向14.1 mg丁香苦苷和羟基酪醇混合物中加入 FITC 荧光标记物 3 mg或不加入 FITC,分散于有机相中,超声溶解,配制浓度为 0.1%F-68 溶液21 mL,形成水相。在1000 r/min磁力搅拌条件下,将有机相滴加到水相中,滴毕,于细胞破碎仪超声60 s,磁力搅拌 1000 r/min,旋转蒸

发(40 ℃)除去有机溶剂,即得 FITC 标记的 SH-NPs (FITC-SH-NPs)或 SH-NPs。

2.2 细胞摄取实验

将密度为1×104 cfu/mL 的 HepG2.2.15 细胞播撒在 12 孔细胞培养板上。分别取 FITC-SH-NPs、FITC溶液和空白 NPs与细胞共孵育24 h。孵育后,用 1 mL PBS清洗3次,消化细胞,置于相应Ep 管中,1000 r/min离心 5 min,最后用 1 mL PBS重悬细胞。选用与 FITC激发波长相近的激发光通道,用流式细胞分析仪分析细胞的摄取情况。结果见图 1。空白 NPs 和 FITC 溶液与 HepG2.2.15 细胞作用后,阳性细胞百分数很低,分别为 1.9%、3.9%,细胞内几乎没有荧光,表明空白 NPs本身无荧光,且 FITC分子在本实验的孵育时间内不能进入细胞,排除了空白NPs 和 FITC 分子对结果的影响。

2.3秋水仙素对细胞摄取抑制作用的考察秋水仙素是一种微管形成抑制剂,能与微管蛋白结合,使微管解聚。微管不仅能维持细胞的形态,更重要的是负责将细胞器从细胞内的一处移到另一处,如将内吞形成的小泡从细胞膜移开,为形成更多的内吞小泡腾出空间。一旦微管解聚,内吞形成的小泡从细胞膜转运到核内体受到抑制,内吞受阻。本实验通过在细胞培养液中加入内吞抑制剂秋水仙素研究细胞摄取过程,结果见图 2。与对照组比较,在同一浓度、同一时间抑制组对细胞摄取的阳性细胞百分数为

5.4%,而不加秋水仙素的对照组对细胞摄取的阳性细

胞百分数为49.9%,表明秋水仙素对细胞摄取有较强的抑制作用。 2.3.1时间秋水仙素细胞摄取抑制作用的影响细胞在 24孔培养板中贴壁生长后,提前3h 在抑

2.3.2浓度对秋水仙素细胞摄取抑制作用的影响细胞在 24孔培养板中贴壁生长后,提前3h 在抑制组的细胞培养液中加入360 µg/mL 秋水仙素,对照组的细胞培养液中不加任何抑制剂,分别加入 125、

250、500 µg/mL FITC-SH-NPs 溶液,于37 ℃孵育2 h,

按“2.3.1”项下方法操作,用流式细胞仪测定,考察不同浓度 FITC-SH-NPs 对细胞摄取抑制作用的影响,结果见图 4。与对照组比较,抑制组的阳性细胞百分数明显降低,表明秋水仙素对细胞摄取存在抑制作

用。125、250、500 µg/mL FITC-SH-NPs 在秋水仙素抑制后孵育相同时间,阳性细胞百分数分别为4.9%、

3.4%、3.9%。

2.4 氯喹对细胞摄取抑制作用的考察氯喹是一种趋溶酶体试剂,为弱碱性,能抑制核内体的成熟,阻断内吞进入细胞的粒子从早期核内体转运到晚期核内体以及从晚期核内体转运到溶酶体,同时升高细胞内酸性细胞器(溶酶体、核内体)的pH 制组细胞培养液中加入360 µg/mL 秋水仙素,对照组细胞培养液中不加任何抑制剂,分别加入500 µg/mL FITC-SH-NPs 溶液,于 37 ℃孵育 0.5、1、2、4、24 h, PBS 冲洗细胞3次,胰蛋白酶消化细胞,流式细胞仪检测,考察时间对细胞摄取抑制作用的影响,结果见图 3。与对照组比较,抑制组阳性细胞百分数显著降低,细胞作用 0.5、l、2h 的阳性细胞百分数相似,分别为 1.9%、2.9%、4.3%,表明秋水仙素对细胞摄取的抑制作用很强;随着 FITC-SH-NPs 与细胞孵育时间

的延长(4、24 h),阳性细胞百分数增加至 42.9%、

56.4%,表明秋水仙素对细胞摄取的抑制作用随时间延长逐渐减弱。 值。本实验通过在细胞培养液中加入内吞抑制剂氯喹研究细胞摄取过程,结果见图 5。与对照组比较,氯喹抑制组对细胞摄取有较强抑制作用。

2.4.1时间对氯喹细胞摄取抑制作用的影响细胞在 24孔培养板中贴壁生长后,提前lh 在抑

2.4.2浓度对氯喹细胞摄取抑制作用的影响细胞在 24孔培养板中贴壁生长后,提前lh 在抑制组细胞培养液中加入516 µg/mL 氯喹,按“2.3.2”项下方法考察 FITC-SH-NPs 浓度对细胞摄取抑制作用的影响,结果见图7。125、250、500 µg/mL FITC-SH-NPs与细胞共孵育,阳性细胞百分数无明显差异,分别为

19.5 %、22.5%、27.6%,表明短时间内细胞摄取不受浓度影响,抑制作用基本维持在同一水平。 制组的细胞培养液中加入516 µg/mL 氯喹,按“2.3.1”

项下方法操作,考察不同孵育时间(0.5、1、2、4、

24 h)对细胞摄取抑制作用的影响,结果见图 6。与对照组比较,抑制组阳性细胞百分数显著降低,当细胞与 FITC-SH-NPs 共孵育 0.5、lh 时,阳性细胞百分数较对照组低,分别为 7.4%、9.7%,随着孵育时间

的延长(2、4、24 h),阳性细胞百分数增加至 16.5%、

38.6%、55.4% ,抑制作用逐渐减弱,表明氯喹对FITC-SH-NPs 的细胞摄取有抑制作用,且与孵育时间相关。 3 讨论近年来关于纳米载体的细胞摄取研究较多。体外细胞培养技术为测定生物材料的生物相容性提供了有效的研究方法,通过这项技术可以研究细胞和纳米载体材料间的相互作用,以纳米粒粒径、电位、包封率、载药量及体外释药行为为考察因素,考察纳米载

体的细胞摄取机制[5]。纳米载体的细胞摄取实验是判断药物是否靶向于细胞内的常用方法,体外细胞培养技术为测定生物材料的生物相容性提供了有效的研究方法,通过此项技术可研究细胞和纳米载体材料间

的相互作用[6]。而荧光标记技术可简单快速地进行细胞摄取的定性、定量研究,因此,本实验结合上述技术,选择2种内吞抑制剂对 SH-NPs 的细胞摄取机制进行了进一步的研究。

由于不同类型的纳米递药系统在与细胞相互作用时会呈现不同的分布和动力学行为,不同结构的纳米载体与细胞膜之间的相互作用力也有所区别,因此,细胞对纳米给药系统的内化过程也存在差异。目前被认可的观点是,纳米载体携带着大分子药物,通过与细胞表面的静电力、氢键等非特异性物理吸附,以吸附性内吞的形式进入细胞,完成细胞的药物转

运[7-10]。因此,本实验采用內吞抑制剂秋水仙素和氯喹进行细胞摄取机制的研究,以FITC 为荧光标记物,采用流式细胞仪分析细胞的摄取情况,通过分析结果可知,秋水仙素和氯喹均能一定程度抑制 HepG2.2.15细胞对SH-NPs的摄取,且HepG2.2.15细胞对SH-NPs的摄取与药物浓度、孵育时间呈正相关,由此可以推断,SH-NPs 被细胞内在化的过程为非特异性吸附内吞。本实验为后续研究工作奠定了基础,丰富了对纳米粒的研究内容,但仍需进一步深入。

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(收稿日期:2017-06-10)

(修回日期:2017-07-05;编辑:陈静)

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