基于气相色谱-质谱联用代谢组学方法的甘肃不同产地当归中挥发性成分与其生长环境关系研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:国家自然科学基金(30960037) 通讯作者:王亚丽,E-mail:cnwy11166@hotmail.com

萨日娜 1,2,潘新波 3,顾志荣 1,2,刘洁丽 1,孙宇靖 1,4,王亚丽 1,4

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.甘肃省人民医院,甘肃 兰州 730000;

3.兰州市第二人民医院,甘肃 兰州 730000;4.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室,甘肃 兰州 730000摘要:目的 基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)代谢组学方法探讨甘肃不同产地当归中挥发性成分与药材生长环境的关系。方法 采用 GC-MS 技术测定 31 批甘肃不同产地当归药材样品中挥发性成分,并通过无监督模式的主成分分析(PCA)和有监督模式的偏最小二乘分析(PLS)对甘肃不同产地当归药材与其生长环境的关系进行分析和评价。结果 PCA 结果表明,甘肃不同产地当归中挥发性成分与海拔、土壤类型具有相关性;PLS 可将 31批甘肃不同产地的当归样品依据海拔差异明显分为3类,不同海拔的当归样品中挥发性成分存在较为明显的差异;分析对比分析PCA 和 PLS得到的线性载荷图,可识别筛选出11个差异特征性成分,通过 NIST11 数据库检索,鉴定出其中7个差异性化合物。结论 甘肃不同产地当归中挥发性成分与其生长的海拔、土壤类型的交互影响具有明显相关性。关键词:当归;甘肃;不同产地;气相色谱-质谱联用;主成分分析;偏最小二乘法

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.020

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)06-0082-05

Relationship Between Volatile Components in Angelicae Sinensis Radix from Different Regions in Gansu Province and Its Growing Environment with GC-MS-based Metabolomics

SA Ri-na1,2, PAN Xin-bo3, GU Zhi-rong1,2, LIU Jie-li1, SUN Yu-jing1,4, WANG Ya-li1,4

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Gansu Provincial Hospital, Lanzhou 730000, China; 3. The Second People’s Hospital of Lanzhou, Lanzhou 730000, China; 4. Key Laboratory of TCM Quality and

Standard of Gansu Province, Lanzhou 730000, China

Abstract: Objective To explore the relationship between the volatile components in Angelicae Sinensis Radix from different regions of Gansu Province and its growing environment with metabolomics based on GC-MS. Methods The GC-MS method was used for detecting the volatile components in Angelicae Sinensis Radix from 31 different regions in Gansu province, and principal component analysis (PCA) and partial least squares (PLS) methods were used for analyzing and evaluating its relationship with the growing environment. Results The results of PCA showed that the volatile components in Angelicae Sinensis Radix from different regions in Gansu province were related to the altitude and the soil types. The PLS method could divide 31 samples of Angelicae Sinensis Radix from different regions in Gansu Province into three groups according to the difference of altitude. There were significant differences in the volatile components in the samples taken at different altitude regions. After analyzing linear loading plots from PCA and PLS, 11 charateristic components were screened out, including 7 compounds were identified by the retrieval of NIST11 database. Conclusion The volatile components in Angelicae Sinensis Radix from different regions in Gansu Province are closely related to the altitude and the soil type.

Keywords: Angelicae Sinensis Radix; Gansu Province; different regions; GC-MS; principal component analysis; partial least squares method

随着植物代谢组学的迅速发展,因其具有的整体性、系统性和综合性特点,逐渐在中医药研究、中药质量控制及中药资源开发等方面得到广泛重视。气相色谱-质谱联用(GC-MS)作为代谢组学重要分析技术,对整体性控制中药的质量及揭示药用植物中代谢物质的变化具有重要意义。主成分分析(PCA)是一种常用的无监督模式识别方法,是将原始数据进行降

维处理,有效找出数据中最“主要”的信息[1]。偏最小二乘法(PLS)是一种有监督的模式识别方法,在了解样本分类信息前提下,寻找已知分类组别之间的

变量差异,或寻找变量和变量之间的相关系数[2]。有报道显示,锰、镁、镍和钾是当归药材的特征性无机元素,当归中无机元素分布与其生长的土壤类型密切

相关[3]。本研究测定 31批甘肃不同产地当归药材中挥发性成分,采用 PCA 和 PLS 分析对比其差异性代谢 物,初步探究当归药材中挥发性成分与其生长环境的关系,为当归道地性的成因提供依据。

1 仪器与试药

HP6890/5975N 型气相色谱-质谱联用仪( Palo

Alto,CA,USA),7683B 自动进样器(Palo Alto,

CA,USA),BS124S 型电子天平(德国 Sartorius),

HY-04型高速粉碎机(北京环亚天元机械技术有限公

司),AS7240B 型超声器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

正己烷(色谱纯),上海中秦化学试剂有限公司。

31批当归药材,于2012年10月采集于甘肃不同产地,经甘肃中医药大学生药教研室晋玲教授鉴定为伞形科植物当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的根,样品用清水洗净,自然阴干后密封,置于2 ℃冰箱保存备用。样品来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 进样条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱: Agilent HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 毛细管柱(30 m×250 —m×0.25 —m);升温程序:初始温度 70 ℃,以 4 ℃/min 升至 130 ℃,

2 ℃/min 升至 170 ℃,8 ℃/min 升至 250 ℃,保持

10 min;He 气柱流量:1.0 mL/min;进样口温度:

250 ℃;进样方式:脉冲不分流;进样量:0.2 μL。

2.1.2 质谱条件

标准EI源(电子能量70 eV),离子源温度230 ℃,接口温度 280 ℃,扫描范围(m/z)40~550 aum。

2.2 供试品溶液的制备将样品粉碎,过 40 目筛,分别精密称定各样品粉末约 5.0 g,置于 100 mL具塞锥形瓶中,加50 mL正己烷溶液,超声提取(功率800 W,频率 50 kHz)

30 min,过滤,合并提取液,用正己烷溶液定容于10 mL容量瓶中,即得。

2.3数据处理

将采集的 GC-MS原始数据保存为CSV 格式。应用 MATLAB6.5 软件进行谱峰平滑去噪、基线校准、标准化、峰识别及峰特征提取等预处理,并通过多元

曲线分辨法分解重叠峰[4-5]。预处理后生成的三维矩阵导入 SIMCA-P11.0 软件进行 PCA,以观察样品的聚集、离散及离群点。PLS用于识别造成这种聚集和离散的主要差异性成分。所筛选出的差异成分在

NIST11 标准质谱库中进行检索。

2.4 甘肃不同产地当归指纹图谱的建立

取样品粉末,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,

按“2.1”项下条件进样,所采集的 GC/MS 数据通过

Matlab6.5 软件建立 31 批当归药材样品 GC-MS 指纹图谱,见图 1。结果显示,各样品的主要特征峰无明显差异,指纹图谱整体特征相似,甘肃不同产地当归药材所含挥发性物质的主要化学成分相近,仅从指纹图谱相似性上无法反映出甘肃不同产地当归中挥发性成分的差异性。

其中,30号样品为离群点,结合样品来源信息,发现

30号样品海拔最低,这可能是造成该样品与其他样品

差异性的主要原因。此外,12号和 14号样品点重叠,且距离其他样品较远,结合样品来源信息,发现这

2 个样品的海拔较高,土壤类型均为黑沙壤土,与其他样品差异性较大。按 PCA 得分图结果,将其第一主成分和第二主成分的空间投影结果划分为A、B区域。A 区域中包括 1~7、15~20、25~28 号样品,结合样品来源信息分析发现,在此区域中的大部分样品的海拔区域为 2300 m左右,且土壤类型相近,多为黑垆土,小部分为褐色土,其中 26 号样品在区域A中相对离散,海拔高度为2750 m,明显高于其他样品,土壤类型为黑钙土和砂壤土,区别于其他样品。

2.6偏最小二乘分析为了进一步验证海拔对当归质量的影响,首先排除土质的影响,采用有监督模式的PLS分析,对不同产地的当归样品按照海拔高低进行分组,判别海拔对当归中挥发性成分的影响。将 31 批当归样品分为

3组:低海拔,产地海拔低于 2300 m的样品;中海拔,产地海拔为 2300~2600 m的样品;高海拔,产地海拔高于 2600 m的样品。

PLS 得分图见图4。可以看出,不同产地的当归样品根据海拔差异能够较为明显分离,说明不同海拔产地的当归样品存在较为明显的差异。其中 11 号和

13号样品聚集在两组分中间,分析原因,发现其海拔相近且介于 2200~2300 m。

PLS 线性载荷图见图5。筛选因产地海拔不同引起的当归挥发性成分差异性物质,鉴定发现,与PCA载荷图得出差异大的物质一致,但是这些差异性物质的峰的高低、正负值不同,说明这些化合物对海拔差异的响应不同。对比 PCA 和 PLS 线性载荷图可以发

现,1、2、11号峰代表的化合物受海拔的影响较小,

主要受土壤类型的影响。3号峰和 5号峰代表的化合物受海拔和土壤类型因素的影响,为各组间差异性最 B区域中包括 8~11、13、21~24、29、31 号样品,对比发现,B区域中样品的平均海拔低于A区域样品的平均海拔。且在 B 区域中,8~11 号及 13 号样品相对聚集,海拔相近,土壤类型相似,均为黑垆土;

~24号样品相对聚集,海拔相近,土壤类型相似,

均为褐色土;29、31号样品相对聚集,二者土壤类型相似,但海拔相差较大。通过以上分析可以初步得出,甘肃不同产地当归药材样品中的挥发性成分与海拔、土壤类型具有相关性。

从 PCA线性载荷图识别筛选出11个用于区别产地差异的特征性物质。通过 NIST11 数据库检索,鉴别出其中的7个差异性化合物,按对应峰的先后顺序编号,结果见表2。

3 讨论在现代中药研究中,代谢组学在药物有效性和安全性、中药资源及质量控制研究等方面具有重要理论

意义和应用价值[6]。许多植物代谢物是中药的活性成分,其种类和含量随品种、生长环境、采集时间及产地加工等因素而变化。

模式识别(pattern recognition)在化学计量学的方法中是解决复杂体系中归类问题和搜索标记物的主要手段。它是将海量多维原始数据通过计算机的压缩、降维和归类分析,然后将样品集按照样品的某种特性根据化学数据矩阵(通常为隐含的)进行分类、

特征选取并寻找其内部规律的一种多元分析技术[7],分为有无监督模式和有监督模式。其中,无监督模式识别方法是根据数据本身的属性来判断样本的类别,如 PCA 和系统聚类分析(HCA)等。有监督模式识别是将已知类别的样本随机分为两部分(训练集和测试集),利用已知类别的训练集建模,通过测试集的正确率来表征建立模型的性能,常见的方法有 PLS

等[8]。PCA为无监督模式中最常见方法,通过样本矩阵提取样本向量,然后提取其变量向量,主要用于观测实验模型中的组间分离趋势及是否有异常点的出

现[9];有监督模式 PLS在代谢组学数据分析中最为常用,此种方法可以最大程度地反映组别之间的差

异[10]。

产地作为中药道地性的重要影响因素之一[11],光照、环境温度、降水量、土壤条件等生态因子随着地理区域的不同发生改变,进而影响药材质量。本研究采用 GC-MS 联用技术测定甘肃不同产地当归中挥发性物质,结合 PCA 和 PLS 进行分析,发现甘肃不同产地当归中挥发性物质与其生长的海拔、土壤类型具有相关性,其中海拔对甘肃不同产地当归挥发性物质的影响更为明显,且通过分析筛选出的甘肃不同产地当归挥发性差异性化合物与其生长的海拔和土壤类型的交互影响有关,为进一步阐明当归道地性的成因提供了一定依据。

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(收稿日期:2017-08-31)

(修回日期:2017-09-19;编辑:陈静)

扫描点数 图 1 31批当归样品挥发性成分GC-MS 指纹图谱

扫描点数 图 3 31批当归样品PCA线性载荷图

从第一和第二主成分的 PCA 得分图可以看出, 31批当归样品有较明显的聚集和离散的分布,说明不同产地当归药材中的挥发性成分存在一定的差异性。

2.5主成分分析

采用 PCA 对 31 批甘肃不同产地当归样品的GC-MS 数据进行分析,得到 PCA 得分图(见图 2)和载荷图(见图3)。 图 2 31批当归样品PCA得分图

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