金桑芪抗毒滴丸HPLC特征指纹图谱研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

刘鸿雁1,吴晶 2,3,刘丽娜 1,贾忠 1,2

1.兰州市肺科医院,甘肃 兰州 730046;2.甘肃农业大学,甘肃 兰州 730070;

3.兰州市中医医院,甘肃 兰州 730050

摘要:目的 建立金桑芪抗毒滴丸 HPLC 特征指纹图谱,对该制剂进行质量控制。方法 采用 Waters XSELECT CSH-C18 色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱,流速为

1.0 mL/min,柱温为 30 ℃,检测波长为260 nm。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素和甘草酸铵为参照物,对10批金桑芪抗毒滴丸进行相似度分析。结果 金桑芪滴丸特征图谱共有24个共有峰,比对出了贯叶连翘、桑白皮、黄芪和甘草的特征峰,各批样品的相似度均在0.9 以上。结论 采用 HPLC 特征图谱可对金桑芪抗毒滴丸实现全面和整体的评价,为有效提高该制剂的质量控制提供参考。

关键词:金桑芪抗毒滴丸;毛蕊异黄酮葡萄糖苷;芦丁;甘草苷;金丝桃苷;槲皮素;甘草酸铵;高效液相色谱法

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.022

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)06-0090-05

Research on HPLC Fingerprint of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills

LIU Hong-yan1, WU Jing2,3, LIU Li-Na1, JIA Zhong1,2

1. Lanzhou Pulmonary Hospital, Lanzhou 730046, China; 2. Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;

3. Lanzhou City Chinese Medicine Hospital, Lanzhou 730050, China

Abstract: Objective To establish fingerprint of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills by HPLC; To control the quality of the preparation. Methods Waters XSELECT CSH-C18 chromatographic column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm) was used and eluted with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid solution gradient at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 260 nm with column temperature of 30 ℃. Using calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, rutin, liquiritin, hyperoside, quercetin and ammonium glycyrrhizinate as the object references, ten batches of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills were tested and analyzed by similarity comparison. Results Fringerprint spectrum of Jinsangqi Kangdu Dropping Pills had 24 common peaks in total, and characteristic spectrums of Hypericum Perforatum, Mori Cortex, Astragali Radix and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma had been found, while similarity of HPLC fingerprint was more than 0.9 among those batches of samples. Conclusion Using HPLC fingerprint can evaluate the Jinsangqi Kangdu Dropping Pills quality totality, which can provide references for improving the quality control of the preparation.

Keywords: Jinsangqi Kangdu Dropping Pills; calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside; rutin; liquiritin; hyperoside; quercetin; ammonium glycyrrhizinate; HPLC

金桑芪抗毒滴丸组方源于兰州市肺科医院感染科的验方,是在继承前贤经典方药的基础上,根据艾滋病的发病原因和致病机理,遵循中医理法和组方原则,参考现代中药研究成果,筛选组合而成。该方长期作为艾滋病患者的辅助用药,具有一定的临床疗效。方中贯叶连翘和桑白皮的活性成分具有抑制人类

免疫缺陷病毒的作用[1-4],黄芪可增强巨噬细胞吞噬

能力[5],对机体各系统均具有正向调节和保护修复作用。为更好地控制生产工艺、确保临床疗效,本研究旨在对金桑芪抗毒滴丸原有质量标准进行提升,采用HPLC建立金桑芪抗毒滴丸活性组分的指纹特征图谱

分析方法[6-7]。通过对特征图谱的特征峰数据进行相似度计算,对金桑芪抗毒滴丸活性组分的特征图谱与原料药特征图谱的相关性进行分析,评价不同批次金桑芪抗毒滴丸样品间的质量差异。

仪器与试药

高效液相色谱仪(Waters 2695,美国),PDA 检测器(Waters 2998);BS224S 型电子天平(北京赛多

利斯仪器系统有限公司);KH-500DE 数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号 111920

201505)、芦丁(批号 100080-201409)、甘草苷(批号 111610-201607)、金丝桃苷(批号 111521-201507)、槲皮素(批号 100081-201509 )、甘草酸铵(批号

110731-201619),中国食品药品检定研究院;金桑芪抗毒滴丸(批号分别为 20161014 、 20161028 、

20161108、20161124、20161212、20161228、20170110、

20170124、20170217、20170314),兰州市肺科医院制剂室。乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Waters XSELECT CSH-C18 色谱柱(4.6 mm×

150 mm,5 μm),柱温为30 ℃,流动相为乙腈(A)

0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~20 min,15%~

43%A;20~38 min,43%~80%A;38~40 min,

80%A),流速为 1.0 mL/min,检测波长为 260 nm,进样量为 20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备取本品研细,取约 5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇 30 mL,密塞,称定质量,超声(功率 250 W,频率 50 kHz)20 min,取出,放冷,再称定质量,用50%乙醇补足减失的质量,混匀,过滤,取续滤液,用 0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.2.2 阴性对照溶液的制备按金桑芪抗毒滴丸处方分别制备不含贯叶连翘、

桑白皮、黄芪、甘草提取物的阴性样品,按“2.2.1”项下方法制备,即得。

2.2.3 对照品溶液的制备精密称取对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素、甘草酸铵适量,分别用70%乙醇溶解,配成浓度分别为0.049 4、1.273、1.970、

0.100、1.190、0.198 mg/mL的单一对照品溶液。分别吸取各对照品溶液 1000、100、200、1300、60、1000 —L置于 5 mL量瓶中,以70%乙醇定容,摇匀,得浓度分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.011 88 mg/mL、芦丁

0.025 46 mg/mL、甘草苷 0.078 8 mg/mL、金丝桃苷

0.026 0 mg/mL、槲皮素 0.014 28 mg/mL、甘草酸铵

0.039 6 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取同一批号金桑芪抗毒滴丸供试品溶液,连续进样 6次,以金丝桃苷作为参照峰,考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。结果各共有峰相对保留时间的RSD 为 0.038%~0.131%,相对峰面积的SD 为 1.143%~1.672%,表明精密度良好。

3.2 重复性试验取同一批号金桑芪抗毒滴丸样品5份,每份 5.0 g,

按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液,进样检测。结果表明,各共有峰相对保留时间的RSD 为 0.066%~

471%,各共有峰相对峰面积的 RSD 为 1.212%~

825%,表明重复性良好。

3.3 稳定性试验取金桑芪抗毒滴丸同一供试品溶液,分别在0、2、

8、12、24 h进样测定。结果表明,各共有峰相对保留时间的RSD 为 0.083%~1.238%,各共有峰相对峰面积的RSD 为 1.463%~2.167%,表明供试品溶液在 24 h内稳定。

4 指纹图谱的建立及共有峰的指认

4.1 指纹图谱的建立

取 10 批金桑芪抗毒滴丸样品,按“2.2.1”项下

方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件测定,得到 10批金桑芪抗毒滴丸HPLC 指纹图谱(见图1)。确定了 24 个共有峰,且共有峰的总面积占总峰面积的 90%,因此确定该 24 个色谱峰为金桑芪抗毒滴丸的指纹图谱共有峰。

以 5 号峰(金丝桃苷)为参照峰,计算 10 批金桑芪抗毒滴丸样品指纹图谱各色谱峰相对保留时间和相对峰面积,结果见表 1、表 2。可见,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%,说

该 10 批金桑芪抗毒滴丸样品的成分及各成分含量均较为稳定。

2.4.2各共有峰的指认分别精密吸取金桑芪抗毒滴丸供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各20 μL进样测定。结果表明,

10批样品特征图谱的色谱峰均在40 min内全部出完,对所得特征图谱进行指认,选择稳定性好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰,共标定了 24 个峰(见图 2)。其中 2、3、4、5、13、19 号峰分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芦丁、甘草苷、金丝桃苷、槲皮素和甘草酸铵峰。

通过对金桑芪抗毒滴丸供试品溶液图谱和贯叶连翘、桑白皮、黄芪、甘草阴性对照溶液图谱进行比较分析,确定各特征峰的药材归属。根据各共有峰的保留时间及紫外光谱信息,确认了 23 个特征峰的来源,其中 1 个峰未得到归属。在特征图谱的 24 个共

有峰中,1、3、5、8、9、13 号峰为贯叶连翘提取物中成分,其中3 号峰为芦丁,5号峰为金丝桃苷,13

号峰为槲皮素;6、11、16、21、22、23、24 号峰为

桑白皮提取物中成分;2、7、10、12、18 号峰为黄芪提取物中成分,其中2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷;

4、14、15、17、19 号峰为甘草提取物中成分,其中

4 号峰为甘草苷,19号峰为甘草酸铵;20号峰为贯叶连翘和甘草提取物成分的共有峰。 2.5 样品相似度评价结果通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)》软件计算得出10批金桑芪抗毒滴丸特征图谱的相似度(见表3)。结果显示,各批样品相似度均大于0.95,且各色谱峰的保留时间匹配较好,相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%。由此可知,各批次药材共有物质出峰时间大致相同,成分较稳定,含量也基本稳定。 讨论由于中药复方具有成分复杂、有效成分不确定等因素,目前中药制剂的含量测定指标选择一直难以统一。在质量标准的建立过程中,往往以含量高、易检测但可能与制剂疗效无关的化学成分作为检测指标。

王翰华等[8]提出,在选择含量测定指标时应综合考虑各药味所含的有效成分、特征成分、毒性成分等,建立多指标含量测定体系。本试验是对金桑芪抗毒滴丸原有质量标准进一步提升,通过对比研究提取条件、色谱条件和检测波长对主要特征成分测定的影响,建立该制剂的HPLC特征指纹图谱。

首先,试验比较了超声提取和回流提取之间的差

异,同时比较了不同浓度乙醇提取(30%、50%、70%)和提取时间之间的差异。结果显示,加热回流提取和超声提取的金丝桃苷含量相当。考虑到超声提取耗能低、简便易行,故采用超声提取法。以金丝桃苷的含量为指标,得到最佳提取条件为 50%乙醇超声提取

0 min。其次,在流动相的选择中,以金丝桃苷的含量为

考察指标,分别评价甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同比例的流动相进行等度和梯度洗脱的效果。

结果显示,梯度洗脱以乙腈-0.1%磷酸为流动相最优,峰形、分离度均较好,各峰的保留时间适中,且分析时间适宜,均在40 min 内完成。

第三,对样品进行全波长扫描,其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷 λmax 为 260 nm,芦丁 λmax 为 257 nm,甘草苷 λmax为 237 nm,金丝桃苷λmax为 254 nm和 357 nm,槲皮素 λmax 为 257 nm,甘草酸铵 λmax 为 237 nm。提取不同吸收波长的色谱图,结果发现在260 nm 波长

处各峰吸收均较好,因此选择检测波长为260 nm。

本试验共考察了 10 批样品共有峰的精密度、稳定性、重复性,其 RSD 和非共有峰总面积占总峰面积比值均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求

[9]

(暂行)》 ,故由此建立的指纹图谱可以用于金桑芪抗毒滴丸的质量控制。

参考文献:

[1] 王刚,姚佳.贯叶连翘金丝桃素提取工艺的优化及含量的测定[J].湖

北农业科学,2013,52(9):2141-2143.

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桃素的含量[J].中国药房,2010,21(11):1020-1022.

[3] 李群.桑白皮化学成分、质量控制、药理及炮制研究进展[J].齐鲁药

事,2011,30(10):596-599,602.

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[7] 冯丽,刘永利,李冬梅,等.银黄颗粒指纹图谱研究[J].中成药,2011,

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[8] 王翰华,沈岳光,陆元勋.浅析中药质量标准中建立多指标含量测定体

系[J].中医药导报,2010,16(10):95-96.

[9] 国家药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要

求(暂行)》的通知[J].中成药,2000,22(10):671.

(收稿日期:2017-10-30)

(修回日期:2017-11-14;编辑:陈静)

mAu 图 1 10批金桑芪抗毒滴丸HPLC指纹图谱 t/min

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