金芪枳术汤对糖尿病胃轻瘫GK大鼠胃动力的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 目次 -

万生芳1,李雅琪2,王晓丽1,舒畅1,魏昭晖1,张磊1,吴红彦1,李荣科 1

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000;2.中国药科大学,江苏 南京 211198

摘要:目的 观察金芪枳术汤对糖尿病胃轻瘫(DGP)GK大鼠胃动力的影响,探讨其作用机制。方法 80只雄性GK大鼠随机选取12只作为正常组,其余68只给予高糖高脂饲料不规则喂养8周制备 DGP 模型,成模大鼠随机分为模型组、阳性药组和金芪枳术汤低、中、高剂量组,干预12 周,测定胃内色素残留率,ELISA

检测血浆多巴胺(DA)、乙酰胆碱(ACh)、5-羟色胺(5-HT)含量,HE染色观察胃窦组织病理变化,透射电镜观察胃窦组织黏膜层超微结构,Western blot 检测胃窦组织 RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达。结果 与正

常组比较,模型组胃内色素残留率升高,DA、ACh、5-HT 含量降低,RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达降低

(P<0.01);与模型组比较,阳性药组和金芪枳术汤高剂量组胃内色素残留率降低,DA、ACh、5-HT含量明

显升高,RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),胃窦组织病理变化和黏膜层超微结构明显改善;与阳性药组比较,金芪枳术汤高剂量组胃内色素残留率、DA含量及 RhoA、ROCK1、ROCK2

蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);与金芪枳术汤低剂量组比较,金芪枳术汤高剂量组胃内色素残留率

明显降低,DA、ACh、5-HT 含量明显升高,RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 金芪枳术汤能提高DGP大鼠胃动力,促进胃排空,改善和修复胃窦组织黏膜层损伤,这可能与其调节RhoA/ROCK 信号通路蛋白表达有关。

关键词:糖尿病胃轻瘫;金芪枳术汤;多巴胺;乙酰胆碱;5-羟色胺;RhoA/ROCK信号通路

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.014

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)09-0056-05

Effects of Jinqi Zhizhu Decoction on Gastric Motility of GK Rats with Diabetic Gastroparesis

WAN Sheng-fang1, LI Ya-qi2, WANG Xiao-li1, SHU Chang1, WEI Zhao-hui1,

ZHANG Lei1, WU Hong-yan1, LI Rong-ke1

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;

2. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China

Abstract: Objective To investigate the effects of Jinqi Zhizhu Decoction (JQZZD) on gastric motility of GK rats with diabetic gastroparesis (DGP); To discuss its mechanism of action. Methods 12 out of 80 male GK rats were randomly selected as normal group, and others were induced to be DGP model by irregular feeding with high sugar and high fat diet for 8 weeks. The model rats were randomly divided into model group, positive medicine group, JQZZD low-, medium-, and high-dose groups. All rats were given continuous intragastric administration for 12 weeks. The residual rate of pigment in stomach was detected and calculated. The concentration of DA, ACh and 5-HT in plasma were detected by ELISA. The morphological changes of gastric antrum were observed by HE staining. The ultrastructure of mucous layer of gastric antrum was observed by transmission electron microscope. The protein expressions of RhoA, ROCK1 and ROCK2 were detected by Western blot. Results Compared with normal group, the residual rate of pigment in model group increased, while DA, ACh and 5-HT, relative amount of protein expressions of RhoA, ROCK1 and ROCK2 decreased (P<0.01). Compared with model group, the residual rate of pigment in positive medicine group and JQZZD high-dose group decreased, while DA, ACh and 5-HT, relative amount of protein expressions of RhoA, ROCK1 and ROCK2 increased (P<0.05, P<0.01), and morphological changes and ultrastructure of mucous layer obviously improved. There was no significant differences in the residual rate of pigment, DA content and protein expressions of RhoA, ROCK1 and ROCK2 between positive medicine group and JQZZD high-dose group 基金项目:国家自然科学基金地区基金(81560718);甘肃省中医药管理局科研项目(GZK-2017-3)

(P>0.05). Compared with JQZZD low-dose group, the residual rate of pigment in JQZZD high-dose group decreased, while DA, ACh and 5-HT, relative amount of protein expressions of RhoA, ROCK1 and ROCK2 increased (P<0.05,

P<0.01). Conclusion JQZZD may improve gastric motility, promote gastric emptying, and improve and repair damage of mucous membrane in the gastric antrum. All of these may be related to regulating protein expressions of RhoA/ROCK signal pathway.

Keywords: diabetic gastroparesis; Jinqi Zhizhu Decoction; dopamine; ACh; 5-HT; RhoA/ROCK signaling pathway

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis,DGP)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)消化道慢性并发症之一,其发病率高。DGP的发病机制复杂,与胃神经病变、胃平滑肌细胞受损等因素有关,其主要病理特征和核心环节是平滑肌细胞受损,RhoA/ROCK 信号通路是平滑肌收缩调节的重要机制,RhoA 是 Ras 同源物基因组成员之一,RhoA 活化后引起一系列下游效应器激活,促进平滑肌收缩。多巴胺(DA)、乙酰胆碱(ACh)和 5-羟色胺(5-HT)等神经递质对于胃肠道平滑肌的收缩均有明显的兴奋作用。本实验以DGP大鼠为研究对象,观察金芪枳术汤对DGP 大鼠胃内色素残留率,DA、ACh 和 5-HT等神经递质活性,胃窦黏膜细胞超微结构及胃窦组织RhoA/ROCK信号通路相关因子 RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达的影响,探讨其促进胃动力的作用机制。1 实验材料

1.1 动物

SPF 级 GK 大鼠 80 只,雄性,9周龄,体质量

(180±20)g,上海斯莱克实验动物有限责任公司,动物合格证号 SCXK(沪)2012-0002。饲养于甘肃中医药大学 SPF级实验动物中心。

1.2 药物金芪枳术汤(鸡内金、红芪、枳壳、白术、黄连、法半夏等),饮片均购于兰州惠仁堂大药房,按传统中药煎煮方法浸泡、煎煮、过滤,恒温水浴浓缩为

5.54 g 原药材/mL药液;枸橼酸莫沙必利片,成都康弘药业集团股份有限公司,批号170216。

1.3 主要试剂与仪器

DA、ACh、5-HT ELISA试剂盒,江苏菲亚生物科技有限公司;抗RhoA 一抗,美国 Abcam 公司;抗

ROCK1 一抗,美国 Genetex 公司,抗 ROCK2 一抗,美国Genetex公司。酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan

MS,352 型),透射电镜(日本 Olympus 公司),光学显微镜(日本 Olympus 公司)。

2 实验方法

2.1 造模和分组

GK大鼠随机选取 12只作为正常组,其余 68 只

参照文献[1-3]方法给予高糖高脂饲料不规则喂养 8

周,随机血糖>16.7 mmol/L,腹部胀大、体质量减轻,

随机抽查胃排空率降低,提示模型复制成功。60只成模大鼠随机分为模型组、阳性药组和金芪枳术汤低、中、高剂量组,每组 12 只。阳性药组予莫沙必利药液 0.7 mg/(200 g•d)灌胃,金芪枳术汤低、中、高剂量组分别予金芪枳术汤1.38、2.77、5.54 g/(200 g•d)灌胃,正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。给药体积 1 mL/(200 g•d),连续 12 周。

2.2 取材

干预第 12周末,大鼠禁食不禁水24 h,1 mg/mL美蓝溶液 0.4 mL 灌胃,30 min后处死大鼠,取全胃,生理盐水冲洗胃残留物并收集冲洗液,离心,取上清液,测定胃内色素残留率。股动脉取血,保留部分血

浆,分离血清,置于-20 ℃冰箱保存。取胃窦一部分组织,多聚甲醛固定,用于光镜下病理观察。取胃窦部 5 mm×5 mm×2 mm大小的组织块,戊二醛固定液固定,透射电镜观察胃窦组织黏膜层超微结构。一部分胃窦组织液氮冷冻保存,用于检测胃窦平滑肌RhoA/ROCK信号通路相关信号因子蛋白表达。

2.3 观察指标

2.3.1 胃内色素残留率大鼠处死后开腹取全胃,沿胃大弯剪开,胃内残留物用6 mL 生理盐水冲洗并收集冲洗液。3500 r/min离心15 min,取上清液,于波长620 nm处检测吸光度(OD)。另取一试管,同一浓度色素 0.4 mL,相同条件下离心,测 OD,作为标准管。胃内色素残留率(%)=测定管OD值÷标准管OD 值×100%。

2.3.2 神经递质含量检测酶标仪检测大鼠血浆 DA、ACh、5-HT 的含量,按 ELISA试剂盒说明书进行操作。

2.3.3 病理观察

胃窦组织4%多聚甲醛固定 24 h,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,常规病理切片,HE染色,光学显微镜观察。

2.3.4 胃窦组织黏膜层超微结构观察

取胃窦5 mm×5 mm×2 mm,戊二醛固定液固

定,蔗糖磷酸缓冲液洗涤2次,四氧化锇固定2 h,丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸铀柠檬酸铅双重电子染色,透射电镜下观察,拍照。

2.3.5 Western blot 检测胃窦组织 RhoA、ROCK1、

ROCK2 的蛋白表达

取胃窦组织50 mg,提取蛋白质,按照试剂盒操作说明进行电泳、转膜、封闭,分别加入抗 RhoA、

ROCK1、ROCK2 一抗和内参 β-actin(浓度 1∶1000)培育过夜。凝胶成像显影拍照,图像分析软件进行分析,各组整合灰度值与内参 β-actin 比较,计算 RhoA、

ROCK1、ROCK2 的相对表达量。 3 统计学方法

采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示,多样本均数间比较采用方差分析,组间多

重比较采用t检验。检验水准 α=0.05。

4 结果

4.1 大鼠一般状况正常组大鼠饮食正常,营养状况良好,毛色有光泽,反应敏捷,体质量渐增;模型组大鼠多饮、多食、多尿明显,精神萎靡,毛色无光泽。模型组大鼠死亡

2只,金芪枳术汤低、中、高剂量组大鼠各死亡3、2、

1只。干预 12周后,各给药组大鼠一般状况较模型组明显改善。

4.2 金芪枳术汤对模型大鼠胃内色素残留率的影响与正常组比较,模型组大鼠胃内色素残留率明显升

高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较, 4.4金芪枳术汤对模型大鼠胃窦组织病理形态的影响

正常组大鼠胃窦组织结构正常,未见充血、水肿及炎性细胞浸润;模型组大鼠黏膜下毛细血管扩张充血,有炎性细胞浸润,腺体排列紊乱;阳性药组大鼠充血、浸润、空泡等病变均有所改善;金芪枳术汤各剂量组大鼠上述病变均明显改善,金芪枳术汤高剂量 阳性药组和金芪枳术汤低、中、高剂量组大鼠胃内色

素残留率明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),金芪枳术汤高剂量组与阳性药组比较无明显差异(P>

0.05);金芪枳术汤低剂量组大鼠胃内色素残留率高于

金芪枳术汤高剂量组(P<0.01)。结果见表1。

4.3 金芪枳术汤对模型大鼠血浆多巴胺、乙酰胆碱、

5-羟色胺的影响

与正常组比较,模型组大鼠血浆 DA、ACh、5-HT

含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,阳性药组和金芪枳术汤低、中、高剂量组大鼠 DA、ACh、5-HT含量明显升高,差异有统计学

意义(P<0.01);金芪枳术汤高剂量组大鼠 ACh、5-HT含量显著高于阳性药组,差异有统计学意义(P<

0.01);金芪枳术汤高剂量组大鼠 ACh、5-HT 含量较金芪枳术汤低、中剂量组明显升高,差异有统计学意

义(P<0.01)。结果见表 2。

— 组效果最明显。结果见图1。

4.5 金芪枳术汤对模型大鼠胃窦组织黏膜层超微结构的影响

正常组大鼠胃窦黏膜细胞间联系紧密,胞内细胞器数量丰富;模型组大鼠细胞间隙增宽,细胞核变形,线粒体肿胀、变性甚至溶解;阳性药组大鼠无细胞核变形、染色质增多现象,线粒体肿胀、溶解的数量较

模型组减少;金芪枳术汤低剂量组大鼠出现细胞核变形,异形染色质增多,细胞质边集,细胞凋亡;金芪枳术汤中、高剂量组大鼠线粒体肿胀、变性数量少于模型组,高剂量组细胞核无变形、染色质增多等异常现象。结果见图2。

4.6 金芪枳术汤对模型大鼠胃窦组织 RhoA、

ROCK1、ROCK2 蛋白表达的影响与正常组比较,模型组大鼠 RhoA、ROCK1、 注:A.正常组;B.模型组;C.阳性药组;D.金芪枳术汤低剂量组; E.金芪枳术汤中剂量组;F.金芪枳术汤高剂量组图 3 各组大鼠胃窦组织 RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达免疫印迹图 5 讨论金芪枳术汤为甘肃省名中医吴红彦教授临床治疗糖尿病胃动力不足经验方,由枳术丸合小陷胸汤化

ROCK2蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<

0.01);与模型组比较,阳性药组和金芪枳术汤高剂量组大鼠 RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达明显升高,

差异有统计学意义(P<0.01);金芪枳术汤高剂量组大鼠 RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白表达显著高于金

芪枳术汤低剂量组(P<0.01),阳性药组与金芪枳术

汤高剂量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3、图 3。 裁而来,方中含鸡内金、红芪、枳壳、白术、黄连、法半夏、丹参等药,全方共奏健脾益气、消食和胃、除痞止呕、行气化瘀、清热生津的功效。枳术丸、小陷胸汤加减治疗 DM 及其并发症疗效确切[4-5]。鸡内金消食导滞兼化瘀滞,红芪为甘肃道地药材,益气健脾升阳,鸡内金和红芪主要成分均有较好降血糖作

。RhoA/ROCK 信号通路在体内普遍存在,介导DM

多种并发症的发生[6],DGP 的发生与 RhoA/ROCK 信

号通路被抑制有关[7-8],ROCK 活化后能增强平滑肌

的收缩力[9]。ACh是胃肠道最主要的一种兴奋性神经递质,能够兴奋胃肠道平滑肌,使其收缩幅度、张力、

蠕动增加。DA、5-HT 是单胺类神经递质,DA 参与

对胃肠动力的调节作用,5-HT 有兴奋哺乳动物胃肠运动的作用。本研究发现,DGP 模型大鼠胃窦组织

RhoA、ROCK1 和 ROCK2 蛋白表达较正常组明显减少,提示 RhoA/ROCK信号转导途径表达下调、活性被抑制与DGP胃动力不足有一定相关性。干预12 周后,阳性药组和金芪枳术汤高剂量组RhoA、ROCK1和 ROCK2 蛋白表达增加,表明金芪枳术汤能提高RhoA/ROCK 信号通路的活性。

本研究中,模型组胃内色素残留率升高,神经递质分泌减少,胃黏膜细胞破坏明显,干预 12 周后,阳性药组和金芪枳术汤各剂量组胃内色素残留率显著降低,神经递质分泌明显增加,黏膜损伤程度得到明显改善,表明金芪枳术汤能够促进胃排空,促进神经递质分泌,在一定程度上修复损坏的胃黏膜。金芪枳术汤保护胃黏膜和促进胃动力的作用机制可能与促进神经递质分泌、上调RhoA/ROCK信号通路有关。

参考文献:

[1] 王飞,郭沛然,韩菲,等.益气养阴化瘀通络中药对糖尿病胃轻瘫大鼠

平滑肌细胞凋亡的影响[J].世界华人消化杂志,2014,22(13):1848-1853.

[2] 彭艳,贺凤娥,万全荃,等.电针对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦 Ghrelin 和GHSR 蛋白及基因表达的影响[J].中国中医基础医学杂志,2016,22(8):

1088-1091.

[3] 段卫娜,张振凌,孔莹莹,等.地黄生熟异用对增液汤降低糖尿病大鼠

血糖的影响[J].中华中医药杂志,2014,29(1):266-268.

[4] 李晓玲,张声生,杨成,等.枳术丸对功能性消化不良大鼠胃平滑肌收缩反应及胃促生长素受体蛋白表达的影响[J].中国中西医结合杂志,

2016,36(2):210-215.

[5] 赵晓敏,杜学荣.加味小陷胸汤治疗功能性消化不良 32 例疗效观察[J].

时珍国医国药,2007,18(7):1741.

[6] 张默函,蔡英兰,朴丽花,等.糖尿病胃瘫大鼠胃窦平滑肌自噬相关蛋

白的动态变化及其意义[J].中国糖尿病杂志,2014,22(7):653-655.

[7] 孙晓萌,朱滢,王庆娥,等.RhoA/ROCK 信号通路在糖尿病结肠肌层中的

表达[J].胃肠病学,2014,19(11):673-677.

[8] BHETWAL B P, AN C, BAKER S A, et al. Impaired contractile responses and altered expression and phosphorylation of Ca2+ sensitization proteins in gastric antrum smooth muscles from ob/ob mice[J]. Muscle Res Cell Motil,2013,34(2):137-149.

[9] WANG Y P, MEREDITH B, NADEENE R, et al. ROCK isoform regulation of myosin phosphatase and contractility in vascular smooth muscle cells[J]. Circ Res,2009,104:531-540.

(收稿日期:2017-12-14)

(修回日期:2018-01-25;编辑:华强)

正常组 模型组 阳性药组 金芪枳术汤低剂量组 金芪枳术汤中剂量组 金芪枳术汤高剂量组

正常组 模型组 阳性药组 金芪枳术汤低剂量组 金芪枳术汤中剂量组 金芪枳术汤高剂量组

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