1株酱香型大曲中高温放线菌的分离和鉴定

Liquor-Making Science and Technology - - News -

王芙蓉1,曾 辉2,许曌昕1,席德州1,王 欢1,曹文涛1 ( 1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025; 2.贵州盛世甲秀酒业有限公司,贵州贵阳 550025)

摘要: 利用GTY培养基自酱香型高温大曲中分离得到1株放线菌F6,对其进行形态学、生理生化代谢特征鉴定,并结合 16S rRNA基因序列分子生物学鉴定及系统发育学分析,结果表明,鉴定F6为高温放线菌( Thermoactinomyces sp)中的普通高温放线菌( Thermoactinomyces vulgaris)。关键词: 酱香型白酒; 高温大曲; 高温放线菌; 分离鉴定

1001- 04-0042-中图分类号: TS262.3;TS261.1;TS261.4 文献标识码: A 文章编号: 9286(2017) 04

Isolation & Identification of a Thermoactinomyces sp. Strain from High-temperature Jiangxiang Daqu

WANG Furong1, ZENG Hui2, XU Zhaoxin1, XI Dezhou1, WANG Huan1 and CAOWentao1 (1.School of Liquor-making & Food Engineering, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 2.Shengshi Jiaxiu Distillery Co. Ltd., Guiyang, Guizhou 550025, China) Abstract: An actinomycetes strain F6 was isolated from high- temperature Jiangxiang Daqu by use of GTY culture mediums. Its morphology, physiological features, biological features, and metabolic features were studied. Combined with 16S rRNA gene sequence molecular biology identification and phylogenetic analysis, strain F6 was identified as Thermoactinomyces vulgaris. Key words: Jiangxiang Baijiu; high-temperature Daqu; Thermoactinomyces sp.; isolation & identification

酱香型白酒是以高温大曲为糖化发酵剂,并通过高温堆积后入窖进行多菌种复合固态纯粮发酵而得,期间涉及了多种微生物的参与,这些微生物在白酒酿造阶段的含量及发酵产物不同对酱香型白酒的风味都有很大的影响。白酒香味物质的形成更是与高温大曲中的有益微生物有着紧密的关系。从微生物角度来说,高温制曲过程中淘汰了大量耐热性差的微生物,因此高温培养的过程实际上相当于一个富集嗜热菌的过程。放线菌是白酒酿造过程中众多微生物的一种,近年来对它与产香

[ 5]的关系有了较为深入的研究1- 。本实验主要是以酱香型高温大曲为原料,分离出高温大曲中的嗜热放线菌,在前人研究的基础上对分离到的放线菌进行生理生化检测和基因测序,为进一步探索该菌与酱香型白酒特殊风味的相关性奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂及仪器样品:茅台镇某酒厂生产的酱香型高温大曲。菌株: F6分离自茅台镇某酒厂生产的酱香型高温大曲。培养基: GTY培养基、ISP2培养基等。试剂及耗材: TaqDNA聚合酶购自天为时代生物有限公司; Gold View 购自北京塞百盛基因技术有限公司;溶菌酶购自 Sigma 公司,蛋白酶K购自Merk 公司,制霉菌素,新制霉素。

主要仪器:超净工作台、灭菌锅、高速冷冻离心机、培养箱等。1.2 实验方法1.2.1 放线菌的分离筛选1.2.1.1 样品的预处理

称取25 g酱香型高温大曲、5 g CaCO3于500 mL的三角瓶中,加入5 mL无菌水使其保持湿润,在28 ℃的培养箱中培养3d后,在100 ℃的烘箱中热处理1 h,加入225 mL的无菌水,在 200 r/min 的摇床上振荡30 min后,在55 ℃的水浴中保持1h。1.2.1.2 抑制剂的选择

将GTY培养基灭菌后冷却到50 ℃,以无菌过滤的方法加入30 mg/mL的新制霉素和20 mg/mL的制霉菌素。1.2.1.3 培养

将经过预处理的样品涂布到GTY培养基上,在55 ℃下培养 48 h[。

6] 1.2.2 形态学观察

将F6菌株接种到ISP2培养基中,采用插片法培养3d后,再观察是否形成基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。并在显微镜下观察菌株的气生菌丝、基内

[7]菌丝、孢子丝等生长情况 。1.2.3 温度敏感性测定

将检测菌接种在ISP2培养基上,分别置于45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃ 4个温度梯度下培养48 h后,观察其生长状况。1.2.4 生理生化特性

生理生化特性鉴定选取明胶液化、淀粉水解、牛奶的凝固与胨化、硝酸盐还原等项目进行。1.2.4.1 明胶液化

[8]将菌种接种于明胶培养基中,以55 ℃培养,分别在 3 d、5 d、10 d、20 d和30 d观察培养基液化程度。在观察前先将菌种管放入冰箱30 min,如明胶凝成固体状态,说明不液化,如试管有液体出现,说明明胶已被液化。1.2.4.2 淀粉水解

[8]将菌种接种在淀粉琼脂面板上,以 55 ℃培养10 d 后,在菌落周围滴加碘液,如菌落周围呈现透明圈时,表示菌种产生淀粉酶。若菌落周围染成蓝色,不出现透明圈者,说明该菌株不产生淀粉酶。1.2.4.3 牛奶的凝固与胨化

[8]将菌种接种在脱脂牛奶管中,以55 ℃培养,分别在第 3天、第 6天、第10天、第20天、第30天各观察1次,如果牛奶形成凝块,为凝固现象。再继续 培养,如凝块分解,则为胨化现象。1.2.4.4 硝酸盐还原

将菌种接种在硝酸盐还原培养液中,55 ℃培养和7d 14 d,分别测定硝酸盐还原的情况。测定时,倒出培养液1 mL于干净试管中,分别加入硝酸盐还原试剂甲液和乙液各2滴,如呈红色反应,即为阳性。1.2.5 16S rRNA基因序列分析1.2.5.1 16S rRNA基因 PCR扩增和序列测定

利用 Ezup 柱式细菌基因组 DNA提取试剂盒(上海生工)提取菌株基因组 DNA,并以基因组DNA为模板,利用通用引物对 16S rRNA基因进行PCR扩增,纯化后的PCR产物送往上海生工进行基因测序。1.2.5.2 同源性分析与系统发育分析

登陆 NCBI(www.ncbi.nlm.gov/blast/)网站,进行同源性分析,并采用 MEGA 5.2 将测得序列与GenBank中的模式菌株16S rRNA序列进行分析,构建系统发育树,获得目的菌的分类地位或它的系统发育地位。 2 结果与分析 2.1 形态学观察放线菌菌株F6在 ISP2培养基上55 ℃插片培养3 d,菌株的形态观察结果描述见表1,菌落特征和显微镜观察结果见图1。 2.2 温度敏感性测定菌株F6在60 ℃条件下不生长,在45~55 ℃温度范围内生长,且最适生长温度为 55 ℃,结果见表。2 2.3 生理生化特征鉴定菌株F6能够使牛奶凝固,且胨化;能还原硝酸

图1 放线菌的特征

盐为亚硝酸盐,具体结果见表3。2.4 16S rRNA基因系统发育分析

对菌株F6进行了16S rRNA扩增,扩增产物进行了序列测定,测定结果见图2。菌株的系统发育树见图3。可确定F6为普通高温放线菌( Thermoactinomyces vulgaris)。

3 讨论及结论

《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第9版中所描述的放线菌目,能产生单孢子的放线菌归为4个属,即高温放线菌属、高温单孢菌属、糖单孢菌属和[9]小单孢菌属 。高温放线菌属( Thermoactinomyces) 注:采用邻接法,根据菌株 16S r DNA部分序列构建的系统发育树。后接编号为GenBank中的收录号。每个分支点处的数字为 Bootstrap(1000 次抽样)的支持百分率。标表1%的序列差异度。 图3 菌株F6的系统发育树

于 1899 年由 Tsilinsky[ 首次描述。它是20世纪前

10]人类所发现的为数不多的几个放线菌属之一。该属的特征是在高温环境下生长快,在气丝和基丝上均有单个孢子形成,存在内生孢子,常见于自然界的高温场所,如堆肥、稻草、蔗渣等。高温放线菌属因其能够形成良好的菌丝体而被归入放线菌目中,但最近有不少学者对该属分类地位提出质疑,这不仅是因为其基于16S rDNA序列分析证明该属的系统进化更接近于芽孢杆菌属,它们还产生具有类似芽孢杆菌属的内生孢子,而且它们的G+C mol %仅为 50 %左右,远远低于其他放线菌属的 65 %~ 75 %。根据分子分类研究结果,有学者将该属并入枯草杆菌菌群。但根据其形态学特征,高温放线菌属明显应归为放线菌类群。现今,国内外许多有关学者均暂时将其定位在放线菌类群中的未定单元

[11]里 。高温放线菌属从其建立至今已有100多年的历史,其存在数量多,分布非常广泛,但到目前为止,仅有为数不多的几个种被发现并生效描述,这说明发现新的高温放线菌的潜力还是非常大的。本研究利用细菌通用引物对F6菌 16S rRNA 基因序列扩增和序列测定,并通过GenBank 数据库进行分析比较和利用MEGA5进行系统进化分析, F6被鉴 定 为 高 温 放 线 菌( Thermoactinomyces sp.)。以基因系统发育分析为基础,结合生理生化试验、形态及培养特征结果,并参考 Yoon 等 的相关报

[12]道,最终确定放线菌 F6为普通高温放线菌( Thermoactinomyces vulgaris)。该菌从酱香型白酒高温大曲中被发现并分离得到,本研究尚属首次。由于高温放线菌生长发育较快,分泌产生的代谢物种类和性质可能会具有其特殊性,由此可以推测该菌作为优势菌种在酱香型白酒特殊性风味的形成过程中具有不可忽视的作用。对其进行全面、准确的多相分类学鉴定是研究其在白酒酿造过程中所发挥功能的必要前提。

本研究针对自酱香型白酒高温大曲中分离得到的嗜热放线菌F6进行多相分类学鉴定,并最终将 F6鉴定为普通高温放线菌( Thermoactinomyces vulgaris)。该菌株具有特殊的生理生化特征及酶 学活性,且是首次从我国酱香型白酒高温大曲中分离并鉴定得到的高温放线菌,具有重要的理论研究与实践应用价值。

参考文献:

[1] CHEN M B, YANG D D, QIAN ZW, et al. Analysis of microorganisms and physicochemical properties in Zaopei during the fermentation of Chinese zhijiangflavor liquor[J].African journal of biotechnology,2010,

3874- 9(25): 3882. [2] SHI S, ZHANG L, WU Z Y, et al. Analysis of the fungi community in multiple-and single-grains Zaopei from a Luzhou-flavor liquor distillery in western China[J].World journal of microbiology and biotechnology,2011,27(8): 1869-

1874. [3] WU Q, CHEN L, XU Y. Yeast community associated with the solid state fermentation of traditional Chinese Maotai-flavor liquor[J].International journal of food

323- microbiology, 2013,166(2): 330. [4] 王涛,赵东,田时平,等.宜宾浓香型白酒酿造过程中可培养细菌的系统发育多样性[J].微生物学报,2011,51(10): 1351-

1357. [5] 蒲岚,王涛,周宇科,等.宜宾多粮型白酒窖房空气中产糖

29-化的霉菌[J].酿酒科技,2012(9): 31. [6] 刘洋,赵婷,姚栗,等.一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离和鉴定[J].生物技术通报,2012(10): 210-

216. [7] 周德庆.微生物学实验教程[M].2版.北京:高等教育出版社,2006:56. [8] 杜连祥,路福平.微生物实验技术[M].北京:中国轻工业出版社,2011:165. [9] 布坎南,吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984:1165. [10] TSIKLINSKY P. Sur les mucedinees thermophiles[J].

500- Ann inst pasteur,1899,13: 505. [11] 李文均,张忠泽,蒋成林.高温放线菌属分类研究进展

759- [J].微生物学报,2002,42(6): 763. [12] YOON J H, KIM I G, SHIN Y K, et al. Proposal of the genus Thermoactinomyces sensu stricto and three new genera, Laceyella, Thermoflavimicrobium and Seinonella, on the basis of phenotypic, phylogenetic and chemotaxonomic analyses[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology,2005,55(1): 395-

400.

图2 菌株F6的测序结果

F6在显微镜下的形态

F6的菌落形态

Newspapers in Chinese (Simplified)

Newspapers from China

© PressReader. All rights reserved.