Influence of Nitrogen Source on S. cerevisiae and Application of Compound Nutrient in Ethanol Fermentation

Liquor-Making Science and Technology - - News -

DONG Kezhi1, CHEN Chunlu1, ZHANG Desheng1, LIU Hui1 and SHI Qing2 (1. COFCO Energy (Zhaodong) Co. Ltd., Suihua, Heilongjiang 152000; 2. State Yeast Technology Research & Promotion Center, Yichang, Hubei 443003, China)

Abstract: In this paper, we summarized the chemical composition of S. cerevisiae and the fermentation raw materials, and the nutritional requirement of S. cerevisiae in ethanol fermentation. Then we analyzed the generating process of ethyl carbamate (EC) with urea as the nitrogen source, and introduced the influence of a compound nutrient on S. cerevisiae and its advantages in practice. (Trans. by HUANG Xiaoli) Key words: S. cerevisiae; ethanol fermentation; fermentation accelerator; compound nutrition; food safety

酵母,作为一种常见兼性厌氧微生物,大量用于面食、酿造、保健等领域。用于酒精发酵的酿酒酵母俗称酒精酵母,该类酵母要求具备较高的耐渗透压、耐受一定的底物(糖)和产物(酒精)、低产副产物能力。随着酒精行业的不断发展,传统的酒精酵母斜面扩培技术早已被酒精高活性干酵母所取代。可以说,具备上述特性的酒精高活性酵母早已成为现代酒精工业生产中所不可或缺的一部分。

然而,纵使各大企业采用了同质化的酒精酵母,但是企业间因发酵水平的不同产生的经济效益也不尽相同。这其中,既有企业发酵设备的差别, 也有发酵方式的不同,更有工艺条件控制的千差万别。发酵设备作为企业经营者最直接的资本输出,受资金和设备发展影响巨大;而发酵方式往往涉及设备改造,受发酵设备影响较大,在此不做具体分析;而工艺条件控制受资金和设备的影响小得多,更多的与工艺人员自身技术和理解相关,具有更多的优化空间。酒精发酵的关键性工艺条件包括营养、温度和保护剂三大类。本文具体就营养一大类中的氮源进行分析,阐述复合氮源营养对酒精酵母的影响,并介绍一种复合氮源营养剂在酒精发酵中的可行性。

1 酒精酵母、原料的组分

酒精酵母属于酿酒酵母种之一,酒精酵母的化学组成与酿酒酵母也高度相似(功能性酿酒酵母除外),酒精酵母的化学组成见表1。

酿酒酵母的营养需求极其复杂,酒精酵母的化学组成成分超过15种 分为大量元素,其他元素

[ 1],以及微量元素,大量元素包括常见的CHONP、、、、等,其他元素包括Ca、K、Mg、Na、S等,而微量元素则包括Fe、Cu、Zn、Co等。其中,大量元素中的C、HO、 作为碳水化合物的主要成分,是原料的主要成分。而NP、和其他元素以及微量元素由于本身含量较低且成本较高而往往被弱化或忽视,尤其以氮源的选择和利用为甚。大量研究表明,酵母作为一个类群能够利用许多不同的化合物作为氮源,已经用硝酸盐、亚硝酸盐、氨、氨基酸和尿素做了大量

[2]的实验。这些化合物之间是可以互相转换的 。酵母菌(真菌)利用铵盐作为氮源。如果以硝酸盐、亚硝酸盐为氮源,则首先转化成铵根,铵根参与谷氨酸的合成,最后进入细胞氨基酸库,进入氮源代谢。而尿素及铵盐作为氮源,则必须经过水解成铵根后供谷氨酸代谢。在以上氮源代谢过程中,涉及到的非氮源物质主要有酶以及酶激活剂,这些物质往往需要额外的添加并且必须适量,否则有重金属

[4]中毒的风险 。

目前,用于发酵酒精的原料主要分为三大类:淀粉质、糖质和纤维质,其中,淀粉质和糖质原料是目前世界范围内使用最广,研究相对成熟的发酵原料。其中,我国发酵酒精的主要原料为淀粉质原料和少量的糖质原料,淀粉质原料主要分为玉米和薯类。玉米原料的化学组成见表2。木薯原料的化学组成见表3。需要说明的是,以表2、表3给出的数值仅仅是 代表值,受地域、种类影响,玉米、木薯的化学组成比例会有不同。

从表2、表 3可以看出,酿酒酵母的氮含量在7.5 %~10 %之间,若以粗蛋白含氮量计算,则酿酒酵母的粗蛋白含量在46.875 %~62.5 %之间,这个数值远远高于玉米或木薯中蛋白质的含量(假设该物质中的蛋白质全部可被酵母利用)。所以,在酒精发酵中补充氮源,并且补充可被酵母完全利用的可同化氮是非常必要的。

2 氮源的分类

目前,用于现代生物发酵的氮源分为两大类:无机氮和有机氮。无机氮是植物、土壤和肥料中未与碳结合的含氮物质的总称。主要有铵态氮、硝态氮和亚硝态氮等,这些氮源主要来自化工生产,且来源广泛,价格相对较低,使用效果显著;而有机氮的概念恰恰相反,有机氮是植物、土壤和肥料中与碳结合的含氮物质的总称,如蛋白质、氨基酸、酰胺等。这些氮源的获得随着现代生物工程的发展而为人们所熟悉,获得途径较为困难,价格较高,但使用效果具有针对性。有机氮根据来源,分为三大类:动物有机氮、植物有机氮和微生物有机氮。动物有机氮主要有牛肉膏、蛋白胨、鱼粉等,这些物质

在生物工程领域被广泛利用,但受认证和风俗禁忌影响,并不能为全世界所接受,若用于酒精生产,一定程度限制了酒精的销售范围;植物有机氮包括黄豆饼粉(最常用)、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉等,这些物质虽来源广泛,但往往是食品加工的废弃物,存在着食品安全的隐患,如果要加工为食品级原料,则成本会成倍上升;微生物有机氮,目前使用最多的是酵母有机氮。酵母是第一个为人类所完全测序的微生物,也是目前被人类所广泛熟知和接受的。在几乎所有国家和地区,酵母被归为食品或食品添加剂一类,不论从风俗禁忌还是法律法规都完全符合安全氮源的要求。

5- 3 不同氮源选择对酵母及酒精发酵的影响[ 7]

真菌对氮源的利用类型是有限制的,除目前没有明确的证实真菌能够固定分子氮外,大部分真菌能够同时利用硝酸盐、铵盐和有机氮,绝大部分真菌不能利用硝酸盐,仅有少部分真菌只能利用有机氮源。不同氮源在酵母中的代谢图见图1。

目前,我们使用的铵盐和尿素都是需要经过酵母菌的一级或多级代谢形成谷氨酸之后才能进一步为酵母所利用,而谷氨酸的合成本身是一个消耗 能量的过程,而酵母抽提物则不同,氨基酸大量存在于酵母抽提物之中,酵母菌利用氨基酸不需要辅酶( NADPH等)、微量元素( Mn、Fe、Cu、Mg等)参与,也就是不消耗ATP,而ATP的合成需要依靠呼吸作用,呼吸作用需要消耗物质,所以使用酵母浸出物(有机氮)可避免因ATP的合成而消耗原本应该转化为酒精的原料,使得这些原料避免被酵母繁殖而消耗,转为酵母菌的酒精发酵底物,同时避免了酒精发酵产生大量的热量,可节约冷却水。

4 尿素生成氨基甲酸乙酯( EC)的代谢途径

在酒精发酵过程中,尿素的来源主要有两种:一是在发酵前作为氮源添加入发酵液中;二是酵母吸收氮源时降解精氨酸生成。当酵母细胞内尿素含量过高来不及吸收利用时,会有一部分尿素被转运至细胞外。分泌到细胞外的尿素和发酵前添加的尿素都有可能和发酵液中的乙醇反应生成氨基甲酸乙酯。氨基甲酸乙酯具有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和较强的致癌性。在食用酒精中,长期摄入微量的胺(氨)类物质也会显著增加各种癌症的发病率。胺(氨)类物质的存在,严重影响了我国传统发酵食品的安全性,限制了我国传统发酵食品的出口贸易和食品文化影响力。

α酿酒酵母可同化氮源( YAN)包括铵盐和含氨基氮的氨基酸(脯氨酸除外,它在有氧发酵时不能作为酵母的氮源)。酿酒酵母对氮的吸收分两步:首先通过特定的透性酶吸收有效的氮源;其次降解氮源参与氮代谢途径。

当培养基中同时存在多种氮源时,酿酒酵母会优先利用丰富型氮源如谷氨酰胺、铵盐、谷氨酸、天冬酰胺等。只有在培养基中缺少上述丰富型氮源或在丰富型氮源已被完全利用的情况下,酿酒酵母才会开始利用精氨酸、尿素、尿囊素、GABA和脯氨酸等贫乏型氮源。这种由缺失丰富型氮源而引起的氮源对贫乏型氮源的转录水平上的去阻遏现象就称之为氮代谢阻遏效应( Nitrogen catabolite repression,NCR)。研究发现,酿酒酵母对几种氮源利用的先后顺序为天冬氨酸/谷氨酰胺>铵盐>谷氨酸>尿素> GABA>脯氨酸,即:酵母浸出物>

图1 不同氮源在酵母中的代谢图

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