毛葡萄及酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷含量分析

张 劲,黄小云,谢太理,杨 莹,管敬喜,谢林君,成 果(广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所,广西南宁 530007)

Liquor-Making Science and Technology - - News - 基金项目:广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2015YM05、桂农科2015YT85、桂农科2015JZ154和桂农科2015JZ150)。2017-02-收稿日期: 28 1986-), E作者简介:张劲( 男,助理研究员,硕士,研究方向为农产品加工及贮藏, mail:86562900@qq.com。1987-), E通讯作者:成果( 女,助理研究员,博士,研究方向为酿酒葡萄生理代谢, mail:berry713@163.com。2017-03-优先数字出版时间: 27;地址: http://kns

摘要: 探索广西野生毛葡萄中功能成分白藜芦醇含量分布,采用高效液相色谱法(HPLC)对毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中的白藜芦醇和白藜芦醇苷含量进行测定。结果表明,除葡萄汁外,毛葡萄、葡萄酒及酿酒皮渣中均存在不同含量的白藜芦醇和白藜芦醇苷,且相同部位白藜芦醇苷含量均高于白藜芦醇。酿酒皮渣中白藜芦醇及白藜芦醇苷的含量最高,具备工业化提取的经济价值,为毛葡萄酿酒废弃物的综合利用提供了理论依据。关键词: 白藜芦醇; 白藜芦醇苷; 毛葡萄; 酿酒皮渣1001- 08-0124-中图分类号: TS262.6;TS261.2;TS261.9 文献标识码: A 文章编号: 9286(2017) 04

Detection of Resveratrol and Piceid Conent in Vitis quinquangularis Rehd and Its Skin Residues

ZHANG Jin, HUANG Xiaoyun, XIE Taili, YANG Ying, GUAN Jingxi, XIE Linjun and CHENG Guo (Viticulture and Wine Research Institute, Guangxi Academy of Agricultrual Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China) Abstract: In this study, the distribution of functional components in Vitis quinquangularis Rehd including resveratrol and piceid was explored. HPLC was applied to determine resveratrol and piceid content in Vitis quinquangularis Rehd skin, seed, juice, wine and skin residues. The results showed that, resveratrol and piceid existed in Vitis quinquangularis Rehd skin, seed, wine and skin residues, but not in grape juice; piceid content was higher than resveratrol content in the same part; and the content of resveratrol and picid was the highest in skin residues, which was of high value for industrialized extraction. This study provided theoretical base for comprehensive utilization of Vitis quinquangularis Rehd pomace. Key words: resveratrol; piceid; Vitis quinquangularis Rehd; skin residues 白藜芦醇( resveratrol,Res)别名芪三酚,化学5-名为 3,4', 三羟基二苯乙烯,分子式C14H12O3,它是植物体在恶劣环境中或受到病原体侵害时分泌的[1]抗毒素,属于天然活性多酚类物质 。白藜芦醇具有抗菌、抗脂质氧化、抗癌、抗血小板凝聚与血管松弛、降低血脂等多种重要的作用,被喻为紫杉醇之[后又一绿色抗癌物质2-3],在保健食品和医药领域中具有可观的开发前景。白藜芦醇分子中的羟基与 葡萄糖结合而形成白藜芦醇苷( Piceid,Pd),又称虎杖苷,白藜芦醇苷和白藜芦醇具有相似的生物活

[ 6]性,在肠道中糖苷酶的作用下分离出白藜芦醇4- 。近年来,白藜芦醇在含量分析、工艺提取、药理作用

[等方面的研究较为广泛7-9],而白藜芦醇苷相关研究较少受关注。目前研究发现,葡萄是含有较多白藜芦醇的植物之一,但不同品种的葡萄或同种葡萄不同部位中所含白藜芦醇的含量差异较大,一般酿酒

品种葡萄白藜芦醇的含量高于鲜食品种葡萄[ 10],葡萄皮中白藜芦醇的含量较高[ 11],葡萄籽、葡萄果穗轴、葡萄叶、葡萄果汁、葡萄酒中也发现不同程度的

[12]白藜芦醇 。

毛葡萄( Vitis quinquangularis Rehd)属于葡萄科( Vitaceae)葡萄属( Vitis.L)真葡萄亚属( E- uvitis)东亚种群之一,原产于中国,是广西野生葡萄中分

[13]布最广、蕴藏量最大的种类 。前人研究发现毛葡萄及其干红葡萄酒中总酚、总类黄酮、总花色苷的含量高于欧亚种赤霞珠葡萄与葡萄酒,有较强的清除自由基及铜原子还原能力[ 14],中国野生种11个种或36个变种株系浆果葡萄中白藜芦醇含量最高为

[15]毛葡萄 。葡萄废弃物中白藜芦醇的研究越来越多[ 16- 18],关于毛葡萄酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷的研究少有报道。本实验探索了白藜芦醇和白藜芦醇苷在毛葡萄中的分布情况,探索利用毛葡萄酿酒皮渣提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的可行性。 1 材料与方法1.1 材料、试剂及仪器

毛葡萄:野生,品种为“野酿2号”,由广西农业科学院生物研究所鉴定,2016年8 月采自广西罗城。

毛葡萄及酿酒皮渣:由广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所酿造工艺研究室利用野酿2号毛葡萄按照干红酿造工艺发酵酿造干红葡萄酒,在酒精发酵结束时分离酿酒皮渣(含葡萄籽)。

毛葡萄鲜样:称取1 kg 鲜果,分离出果皮、果籽。果肉经匀浆、离心( 8000 r/min,10 min),取上清液备用。果皮和果籽分别加液氮粉碎,冷冻干燥- ( 58 ℃, 24 h)。葡萄皮和葡萄籽干粉备用。

毛葡萄酿酒皮渣:称取1 kg酿酒皮渣,分离出葡萄皮渣与葡萄籽,经60 ℃热风烘干,粉碎,干粉备用。

试剂:白藜芦醇、白藜芦醇苷( HPLC),Sigma;乙腈(色谱级), Fisher;乙酸乙酯,(分析纯);甲醇(色谱级), Fisher;水为实验室超纯水。

LC-仪器设备:高效液相色谱仪( 20AT),日本

TG16-岛津;高速离心机( WS),湖南湘仪;真空冷

1-冻干燥机( Alpha 2LDplus),德国 Christ;超声波清洗机( XUB25),Grant;电热鼓风干燥箱,上海跃

RE-进;旋转蒸发仪( 52AA),上海亚荣。1.2 实验方法1.2.1 白藜芦醇、白藜芦醇苷的提取

葡萄皮、葡萄籽样品:准确称取经干燥粉碎后的葡萄鲜果分离的葡萄皮、葡萄籽及酿后葡萄皮渣和葡萄籽各1.0000 g,加入10 mL乙酸乙酯,混匀,超声30 min,4 ℃冰箱中放置48 h,离心取上清液,40 ℃真空浓缩至干,残留物用甲醇溶解后定容至5 mL,经 0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液上机进行HPLC分析。

葡萄汁、葡萄酒样品:离心后的澄清葡萄汁样品及葡萄酒样品经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液上机进行HPLC分析。1.2.2 HPLC分析

色谱条件:岛津InertSustain C18(250mm×4.6mm× 5 μm),流动相:乙腈∶水=40∶60(v/v),检测器: UV检测器,流速: 0.60 mL/min,波长 306 nm,柱温: 30 ℃,进样量: 10 μL。

标准曲线绘制:准确称取白藜芦醇和白藜芦醇苷标准品适量,用甲醇配制成 0.94 mg/mL的白藜芦醇标准母液和0.79 mg/mL的白藜芦醇苷标准母液。取母液,用甲醇配制系列浓度白藜芦醇和白藜芦醇苷混合对照溶液,其中白藜芦醇对照液浓度为0.0094 μg/mL、0.047 μg/mL、0.094 μg/mL、0.47 μg/mL、0.94 μg/mL、4.7 μg/mL、9.4 μg/mL、18.8 μg/mL,白藜芦醇苷对照液浓度为0.079 μg/mL、0.158 μg/mL、0.79 μg/mL、3.95 μg/mL、7.9 μg/mL、19.75 μg/mL、39.5 μg/mL、79 μg/mL,经 0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液10 μL在上述的色谱条件下上机进行HPLC分析。 2 结果与分析 2.1 白藜芦醇、白藜芦醇苷线性关系的考察经HPLC分析,白藜芦醇苷标准品在5.383 min出峰,白藜芦醇标准品在9.204 min时出峰,色谱图见图1。以标准品浓度为横坐标( X),以峰面积为纵坐标( Y),绘制标准曲线,见图2、图3,标准曲线

2.2 白藜芦醇和白藜芦醇苷测定结果根据HPLC分析结果,样品HPLC色谱图见图4,样品中白藜芦醇苷出峰时间为5.4 min左右,白藜芦醇出峰时间为9.2 min左右。根据出峰时间和峰面积用标准曲线计算出各样品中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量,数据结果见表1、表2。

结果表明,除葡萄汁外,葡萄酒、葡萄鲜果中葡萄皮、葡萄籽以及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中均含有白藜芦醇和白藜芦醇苷;毛葡萄酒中存在白藜 芦醇和白藜芦醇苷,而葡萄汁中未检出,说明葡萄皮、籽中白藜芦醇及其苷可以通过发酵浸渍转移

[19]到葡萄酒中。根据陈雷等 的研究,对市售国产的11种红、白葡萄中白藜芦醇进行含量测定,其含量为 1.0~92.0 μg/100 mL,大部分在 1.0~2.0 μg/ 100 mL之间,本实验测定毛葡萄酒中白藜芦醇含量为 49.9 μg/100 mL,表明广西毛葡萄酒中白藜芦醇的含量高于多数国产市售葡萄酒。对比侯建

[20]波等 研究,其测定的75种进口红葡萄酒的白藜芦醇苷含量为0.34~5.8 mg/L,本实验测定毛葡萄酒白藜芦醇苷含量为26.767 mg/L,表明广西毛葡萄酒中白藜芦醇苷含量远高于部分进口葡萄酒。

从含量分布上看,毛葡萄不同部位白藜芦醇及其苷的含量差异显著。白藜芦醇含量从高到低为:酿酒葡萄皮渣>鲜果葡萄皮>鲜果葡萄籽、酿酒葡萄籽,葡萄籽、酿酒葡萄籽只有微量;白藜芦醇苷含量从高到低为:酿酒皮渣>鲜果葡萄籽>鲜果葡萄

皮>酿酒葡萄籽,酿酒葡萄籽只含微量;鲜果中皮、籽含量的差异可能与葡萄不同组织部位间合成白藜芦醇和白藜芦醇苷的能力不同有关;对比酿酒前后,鲜果葡萄籽白藜芦醇苷远高于酿酒葡萄籽,表明白藜芦醇苷容易通过发酵浸渍进入酒体。前人研究发现白藜芦醇主要是在葡萄浆果表皮合成[ 21],而果肉中白藜芦醇很少或不存在[ 22],与本实验结果一致。白藜芦醇和白藜芦醇苷具有难溶于水,易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮的理化性质[ 23],葡萄酒酒精度约为12 %vol,通过发酵浸渍,葡萄皮和籽中一部分的白藜芦醇及其苷可以转移到葡萄酒中,但是酿酒皮渣中的白藜芦醇和白藜芦醇苷含量仍旧很可观。一般酿酒厂在发酵结束后会直接把酿酒皮渣当作垃圾直接丢弃,如果我们能利用酿酒皮渣提取富集白藜芦醇和白藜芦醇苷,不仅能变废为宝还避免了对环境造成污染。本实验研究为毛葡萄酿酒废弃物的综合利用提供了理论依据。2.3 精密度实验

精密称取毛葡萄皮粉1.0000 g,各平行7次,按照样品提取方法处理,测定含量,结果表明,葡萄皮中白藜芦醇平均含量为 13.411 μg/g,RSD 为1.378 %,白藜芦醇苷平均含量为20.859 μg/g,RSD为 4.610 %,表明实验的提取和测定方法精密度良好。2.4 稳定性实验

精密称取毛葡萄皮粉1.0000 g,按照样品提取方法处理,在0~12 h内每隔1h测定1次含量,结果表明,在12 h内葡萄皮内的白藜芦醇和白藜芦醇苷峰面积无明显变化,13次样品测定,白藜芦醇平均含量为13.250 μg/g,RSD为2.160 %,白藜芦醇苷平均含量为21.004 μg/g,RSD为2.833 %,表明样品提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的测定稳定性良好。2.5 回收率实验

精密称取9份各1.0000 g毛葡萄皮干粉,分为3组平行,每组分别加入79 μg/mL的白藜芦醇苷标液各0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL和94 μg/mL的白藜芦醇标液各 0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL,每组平行3份,按照样品提取和测定方法实验,结果表明,9次实验白藜芦醇苷平均回收率为102.040 %,RSD为 3.080 %,白藜芦醇平均回收率为99.316 %,RSD为4.710 %,表明本实验方法回收率良好,可以满足分析要求。 3 结论

本研究采用HPLC法测定了广西毛葡萄中葡萄皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒以及酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量。葡萄汁中未检测出白藜芦醇及其苷,其余样品均检测到不同含量的白藜芦醇及其苷。葡萄酒中白藜芦醇和白藜芦醇苷能通过发酵浸渍进入葡萄酒中,葡萄酿酒皮渣中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量最高,具备富集利用价值,为利用毛葡萄酿酒皮渣提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的可行性提供了理论依据。

参考文献:

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[2,4]中,对人体健康产生威胁,严重到甚至可致死亡 。

2757—国家执行标准GB 2012 中规定:酒中氰化

[5]物含量需小于8 mg/L。目前,检测酒中氰化物浓度

-的方法有很多:巴比妥酸 异烟酸比色法能够测定植物酶解反应中氰化物含量,是国标GB/T 5009.48中氰化物检测方法,但该方法显色剂不易保存,检测结果中常存在浑浊现象干扰测定,且检测限为0.10 mg/kg,不能满足更为微量的测定要求 6,7];

[ - Giorgio Nota 建立的顶空 气相色谱法突破性采用ECD检测器,提高了氰化物检测的灵敏度,但酒中

-的高浓度乙醇会对检测结果产生影响[ 8,9];吡啶 吡唑酮法灵敏度高,是氰化物检测的国家标准方法之一,但该方法操作复杂,同时作为试验试剂的吡啶

[10]易挥发,且对人体产生毒害作用。本研究根据《中国药典》2015年版氰化物检测法第二法,氰化物水解产生氰化氢与三硝基苯酚锂反应生成红色异红紫酸盐,通过采用紫外可见分光光度法测定3种酒中氰化物浓度,进而比较不同酒种类对氰化物浓度检测的影响。

目前,在国内关于酒中氰化物浓度测定的研究报道较多,关于同一检测方法下不同种类酒氰化物浓度比较的报道较少,因此,本研究对不同种类酒氰化物浓度比较的准确度及精密度的评定与后续相关研究的展开具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂酒样:木薯酒购自常州市启迪化工有限公司;白酒购自江苏博汉工贸有限公司;红酒购自中国长城葡萄酒有限公司。UV-试验仪器: 1800紫外可见分光光度计,日本岛津;石英比色皿; 100 mL量筒; 10 mL烧杯; 200 mL具塞广口瓶;电子天平(精度 0.0001 g)。2,4,6-试剂及耗材:氰化钠固体; 三硝基苯酚(分析纯);碳酸锂(分析纯);氰化钠固体购自中国2,4,6-药科大学危险品仓库; 三硝基苯酚(分析纯)购自西陇化工有限公司;碳酸锂(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;三硝基苯酚锂试液:称取2,4,6- 0.25 g碳酸锂与0.50 g 三硝基苯酚溶于80 mL 沸水中,室温下冷却,用蒸馏水定容到100 mL。标准氰化钠溶液:称取18.85 mg的氰化钠固体

μg/用蒸馏水定容到500 mL,稀释到20.00 mL。1.2 实验方法1.2.1 吸光度标准曲线的制定

移取0.40 mL、1.00 mL、2.00 mL标准氰化钠溶液置于3个200 mL具塞广口瓶中,分别加蒸馏水至

μg/ μg/ 5 mL,摇匀,得浓度分别为1.60 mL、4.00 mL、

μg/ 8.00 mL的氰化钠溶液,同时设置1个200 mL具塞广口瓶加入蒸馏水5 mL作为空白组。将4个精密加有1 mL三硝基苯酚锂试液的10 mL烧杯分别置于上述4个具塞广口瓶中,密塞,在暗处25 ℃放置 14 h后取出烧杯,精密加水 2 mL,混匀,测定

- 500 nm处吸光度,绘制浓度 吸光度曲线。1.2.2 测定酒样中的氰化物浓度

分别取红酒、白酒、木薯酒 3 种酒各 5 mL于200 mL具塞广口瓶中,将3个精密加有1 mL三硝基苯酚锂试液的10 mL烧杯分别置于3个具塞广口瓶中,密塞,在暗处25 ℃放置14 h后取出烧杯,精密加水2 mL,混匀,测定500 nm处吸光度,通过浓

-度 吸光度标准曲线得3种酒中氰化物浓度。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制将配制的氰化钠溶液进行全波长扫描(图1),同时根据《中国药典》2015年版中关于氰化物检测法第二法中的说明,采用 500 nm作为检测波长。氰化钠标准曲线(图2)显示,氰化物的吸光度与氰化物浓度的线性回归方程为Y=0.1386X+ 0.05252,相关系数为 0.98062,表明氰化物浓度在 0.00~ μg/ 8.00 mL范围内,氰化物浓度与吸光度呈良好的线性关系。2.2 不同酒样中的氰化物浓度(表1)从表1可以看出,3种测试酒样中氰化物浓度顺序为红酒<白酒<木薯酒,其中,氰化物浓度最μg/高的木薯酒为0.86 mL,氰化物浓度最低的红酒μg/为0.38 mL。许多酒原料中含有氰化物或氰苷, [11]如木薯、玉米、高粱、杨梅、葡萄籽等 。植物、水果中的氰苷常见有苦杏仁苷、野樱苷、亚麻苦苷等,不

同种类植物中氰化物或氰苷含量相差较大:木薯原料中含有高含量亚麻苦苷,木薯叶分解产生的氰化氢含量为 202.7~284.8 mg/kg,木薯块根分解产生的氰化氢含量为46.8~92.6 mg/kg[ 12],同时苦木薯中氰化物含量高于甜木薯[ 13,14];桃仁中苦杏仁苷含

μg/量为 47.7~275.1 g[ 15];枇杷仁、樱桃仁中苦杏仁苷含量为2.67 %± 0.05 %[ 。葡萄酒以葡萄为原料

16]发酵而成,在发酵过程中,亚麻苷在亚麻苦苷酶与β-

糖苷酶的作用下降解,随发酵时间延长,氰化氢释放量减少。白酒与木薯酒属于蒸馏酒类,在蒸煮

[17,18]过程时,有少量未挥发的氰化氢残留在酒中 。 市售白酒多以高粱、小麦、玉米等为原料酿造,这些原料中氰化物或氰苷含量低于木薯。在此次研究检测的不同种类酒中,果酒氰化物浓度低于粮食型蒸馏酒类,白酒检测出氰化物浓度低于木薯酒,与

[ 16]前人的研究结果一致12- 。

图3 3种酒在不同波长下的吸光度

白酒、木薯酒为无色透明液体,红酒中花色苷使

[19]红酒呈现出颜色 。图3为3种酒在不同波长下的吸光度。从图3可以看出:在紫外吸收波长范围内, 3种酒样均有明显吸收,但是在 450~480 nm范围内,干扰迅速降低至很低水平,在检测波长500 nm处3种酒均未见明显干扰,表明不同种类酒可以采用紫外可见分光光度法进行测定。相对传统的半定量方法、灵敏度低的比色法及一些需要昂贵仪器的方法,本文探讨的紫外可见分光光度法可以是测定不同酒中氰化物浓度经济有效、切实可行的分析方法。

3 结论

根据《中国药典》2015年版中关于氰化物检测法第二法,采用紫外可见分光光度法测定3种酒中-氰化物浓度,氰化钠浓度 吸光度标准曲线结果显μg/示氰化物浓度在0.00~8.00 mL范围内,与吸光度呈良好的线性关系。进一步研究表明,3种供测试的酒中氰化物浓度顺序为红酒<白酒<木薯酒, μg/其中氰化物浓度最高的木薯酒为0.86 mL;氰化μg/物浓度最低的红酒为0.38 mL。不同种类酒采用紫外可见分光光度法进行测定,在检测波长500 nm处均未见明显干扰。因此紫外可见分光光度法是

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