Protective Effects of Compound Pueraria Drink on Mice with Alcoholic Liver Injury

LIU Chao1, DONG Xiaoyuan2, YUAN Yuan3, WU Hao2 and LI Liang2 (1.Engineering and Technology College, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430064; 2. Tianlong Huanghelou Distillery Co. Ltd., Wuhan, Hubei, 430050; 3. Hubei Provincial Center for Disea

Liquor-Making Science and Technology - - ENTERPRISES MANAGEMENT -

Abstract: In this study, the protective effects of compound pueraria drink on mice with acute alcoholic liver injury were investigated. SPF Kunming mice were randomly divided into blank control group, alcoholic injury model group and compound pueraria drink group (low, medium and high dose group respectively as 5.17 mL/kg · BW, 10.34 mL/kg · BW and 15.51 mL/kg · BW).Two models of acute alcoholic liver injury were established as follows: the first group of mice, after 12 hours of fasting but with access to water, disposable gavage administration(20 mL/kg · BW), 30 min later, administered with 50 % vol ethanol (16 mL/kg · BW); the second group of mice were administered with appropriate concentration of subjects for 30 days. On the 31st day, the mice from all groups except

No.9(Tol.279) the blank control group were administered with 50 % vol alcohol (16 mL/kg · BW), and then the first group of mice were subjected to dislocation death to assay the activities of ALT and AST in serum, the contents of TG and MDA and the activities of ADH in hepatic tissue. The second group of mice were subjected to dislocation death to assay the activities of ALT and AST in serum, the contents of TG and MDA and the activities of GSH- px and SOD in hepatic tissue, and the pathologic examination of hepatic tissue. The results suggested that, compared with the alcoholic injury model group, the activities of ALT and AST in serum ADH in each compound pueraria drink group presented evident decrease, besides, the activities of ADH decreased significantly, and the activities of GSP- px and SOD in liver tissue increased and TG and MDA content in liver tissue decreased (P<0.01). There was statistically significant difference in liver fat cells degeneration score between the two groups. Accordingly, compound pueraria drink had significant protective effects on mice with alcoholic liver injury. Key words: compound pueraria drink; alcoholic liver injury; protective effects

随着社会和经济发展,饮酒已成为一种人们的普遍行为,长期过量的饮酒导致的问题已成为全世界

[1]关注的公共卫生问题 。研究表明,饮酒与冠心病、高血压、动脉粥样硬化等疾病的发生呈“J”型曲线 。

[2]根据乙醇在体内的代谢特点,主要从两方面发挥解酒作用:其一,抑制乙醇的吸收,加强胃肠首过效应,降低血液中的乙醇含量;其二,药物直接作用于肝代谢酶系,加速乙醇及其代谢产物的消除速

[3]率,减轻乙醇对组织和细胞的损害 。

复方葛根饮料主要原料为葛根、枳椇子、枸杞、山楂、金银花,这些原料全部为国家卫生部批准的“药食同源”的食材,这些食材都具有明显的解酒的

[ 8]功效,改善酒精中毒的症状4- 。葛根素是葛根的主要活性成分之一[ 9],属于异黄酮类化合物[10]。现代医学研究表明,葛根素具有以下药理作用:扩张冠状动脉、抗心肌缺血、减慢心率、降低心肌耗氧量[ 11];抗脂质过氧化和消除自由基、降血糖、降血脂[ 12- 14];抑制血小板凝集、改善微循环、抗动脉粥样硬化、改善脑循环[ 15],并对脑缺血及缺血再灌注引起的神经细胞损伤具有保护作用[ 16- 18],可对抗慢性乙醇中毒引起的记忆减退,提高脑SOD活性,减少脑内脂褐素累积,逆转乙醇导致的海马突出界面细微结构的衰退性变化[ 19];葛根素腹腔注射可显著降低大鼠酒精摄入量,作用机制可能与其抑制线粒体醛糖还原酶有

[20]关。

枸杞多糖是枸杞子的主要有效成分,临床研究表明,枸杞多糖具有免疫促进和免疫调节能力、保

[21]肝、抗应激作用以及辐射防护等药理作用 。

枳椇子含葡萄糖、果糖、硝酸钾、过氧化酶等成 分,能清除饮酒后体内产生的过量自由基,阻碍过氧化脂质的形成,从而降低乙醇在血液中的浓度,减轻

乙醇对肝组织的损伤[22]。枳椇子能明显缩短乙醇诱

导的小鼠睡眠时间,并能降低血中乙醇的浓度[23]。

山楂黄酮是山楂的主要有效成分之一,山楂黄酮提取物使大鼠血脂中的总胆固醇、低密度脂蛋白含量明显降低,对甘油三酯、高密度脂蛋白有调节

作用[24]。

本研究利用葛根、枳椇子、枸杞、山楂、金银花等药食同源的食材生产复方葛根饮料,依照《食品安全性毒理学评价程序和方法》,对其进行保肝护肝的试验,旨在为复方葛根饮料作为解酒饮料提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料处理工艺流程1.1.1 复方葛根饮料生产工艺流程

→ → → → → →植物浸提 过滤 调配 过滤 灭菌 灌装 二次灭→ → → → →菌 冷却 装箱 入库贮存 检验 出厂1.1.2 植物浸提

在浸提罐中放入 1t的纯净水,加热到 85~ 90 ℃,然后加入3 kg金银花,保温30 min,搅拌。1.1.3 过滤

将浸提后的溶液用100~200目滤网进行过滤,去除滤渣。1.1.4 二次浸提

将第1次浸提过的金银花再投入到浸提罐中,在 85~90 ℃的1t纯净水中浸提20 min,然后用100~200目过滤网过滤。

1.1.5 溶糖

将溶糖缸加500 L纯净水,升温至60~65 ℃后加入2.0 kg葛根提取物、0.25 kg山楂提取物、1.0 kg枸杞提取物、1.0 kg枳椇子提取物,高速搅拌15 min完成后通过5 μm过滤。将溶糖缸加500 L纯净水,升温至80 ℃,先加入白糖溶解,待温度下降到50~ 55 ℃后再加入蜂蜜溶解,完成后通过 5 μm滤膜过滤。1.1.6 调配及定容

加入第2次浸提液以及溶糖缸料液,然后用纯净水将料液定容到“升”。1.1.7 过滤将定容好的饮料双联过滤( 5 μm/1 μm)以及用μm 0.45 的过滤膜进行过滤。1.1.8 灭菌

将过滤后的物料通过UHT进行杀菌,条件为: 90 ℃, 5s。1.1.9 灌装封口

将物料控温到85~88 ℃进行灌装,二重卷封符合要求。1.1.10 二次灭菌

将灌装好的产品放入灭菌釜进行二次灭菌,灭菌条件为121 ℃± 1 ℃,保温25 min。1.1.11 冷却

将灭菌后的产品迅速冷却到常温。1.1.12 装箱

将灌装合格的产品打印日期,并按规定数量进行装箱。1.1.13 入库贮存

贮存温度为常温,避免阳光直射。1.1.14 检验

按成品的质量要求进行检验。1.1.15 出厂产品检测合格后方可投放市场。复方葛根饮料,成人推荐摄入量为310 mL/60 kg · BW。受试物采用旋转蒸发仪60~70 ℃减压蒸馏得到10倍的浓缩液。1.2 试剂与设备

无水乙醇(分析纯) ,国药集团; ADH测定试剂

133盒,批号20150420;MDA测定试剂盒,批号20150312, GSH-

px测定试剂盒,批号 20150417;SOD 测定试剂盒,批号20150106,均购自南京建成生物工程研究所; AST测定试剂盒,批号150169;ALT测定试剂盒,批号 150389;TG测定试剂盒,批号 150386,均购自上海丰汇医学科技有限公司; 7020型全自动生化分析仪,日立公司。1.3 动物实验及饲养SPF级昆明种小鼠,由湖北省实验动物研究中

2008心提供,实验动物生产许可证号为SCXK(鄂) 0005,质量合格证号: NO.42000600009233;饲养环境: SPF级动物实验室,温度 20~26 ℃ ,湿度

201240 %~70 %,使用许可证号为 SYXK(鄂) 0065,设施使用证号: NO.00135021。1.4 实验方法1.4.1 治疗性给药对急性酒精中毒小鼠的影响

SPF级昆明种雄性小鼠130只,体重为20~24 g,分为2批实验组,每批实验组动物数为 65只。每个实验随机分为5组,每组 13只。按照人群推荐用量 0.517 mL/kg · BW(10倍浓缩液)扩大10倍、20倍、30倍设置 5.17 mL/kg ·、BW 10.34 mL/kg ·、BW 15.51 mL/kg · BW 3个不同剂量组,同时设正常对照组和模型对照组。

各组小鼠禁食不禁水12 h后,除正常对照组外以50 %vol乙醇(16 mL/kg · BW)灌胃1次,30 min后一次性灌胃给药(20 mL/kg · BW)或纯水,6 h后眼眶取血并颈椎脱臼处死小鼠,立即剖取肝脏,取0.5 g肝脏制备肝匀浆后,检测血清ALT、AST 活性,肝组织ADH活性, TG、MDA含量。ADH、MDA的检测方法及计算方法均参照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明, ALT、AST、TG采用日立公司生产的7020型全自动生化分析仪检测。1.4.2 酒精肝损伤保护试验

SPF级昆明种雄性小鼠75只,体重为20~24 g,随机分为 5 组,每组 15只。按照人群推荐用量0.517 mL/kg · BW(10倍浓缩液)扩大10倍、20倍、30 倍设计 5.17 mL/kg ·、BW 10.34 mL/kg ·、BW 15.51 mL/kg · BW 3个不同剂量组,同时设正常对照组和模型对照组。

各剂量组每日经口灌胃相应浓度的受试物,小鼠灌胃容量均为20 mL/kg · BW,正常对照组和模型对照组给予等量纯水。动物每周称重2次,按体重变化调整受试物灌胃量,试验第30天模型组及各剂量组一次灌胃给予50 % vol乙醇,正常对照组给予等量的纯水,禁食16 h称重后,眼眶取血并颈椎脱臼处死动物,立即剖取肝脏。取 0.5 g肝脏制备肝匀浆后,检测血清ALT、AST 活性,肝组织TG含

GSH-量, MDA、 px、SOD活性及肝脏病理组织学检

GSH-查。MDA、 px、SOD的检测方法及计算方法均参照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明, ALT、AST、TG采用日立公司生产的7020型全自动生化分析仪检测。1.4.3 肝脏病理组织学检查1.4.3.1 病理观察材料

将实验1.4.2中动物肝脏从肝左叶中部做横切面取材,冰冻切片,油红O染色。在光学显微镜下观察肝细胞损伤程度。1.4.3.2 评价方法

镜检,从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化,用40倍物镜连续观察整个组织切片,主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积。1.4.3.3 评分标准

分别记录每个视野中的各种病变所占视野的面积,累计所观察视野的病变总分。

肝细胞内脂滴分散、稀少0分;含脂滴的肝细胞不超过1/4计1分;含脂滴的肝细胞不超过1/2计2分;含脂滴的肝细胞不超过 3/4 计3分;肝组织几乎被脂滴替代计4分。1.5 统计学方法

采用 SPSS19.0软件对实验数据进行分析,单因素方差分析检验组间数据是否具有显著性差异, 数据用X±s表示,以P<0.05及P<0.01为差异具有统计学意义。2 结果与分析2.1 治疗性给药对小鼠急性酒精中毒作用研究结果

实验结果显示(见表1),肝损伤模型对照组与正常对照相比,酒精可导致模型对照组小鼠血清中ALT和AST活性升高,且ALT存在显著性差异(P< 0.05)。与模型对照组比较,高剂量组小鼠血清中AST活性有显著降低(P<0.05)。

肝损伤模型对照组与正常对照组相比,酒精可使模型对照组小鼠血清TG水平显著上升(P< 0.01)。与模型对照组比较,复方葛根饮料中、高剂量组治疗性给药可明显降低肝组织TG含量(P< 0.01)。

实验结果显示(见表2),与正常对照组比较,模型对照组肝组织ADH有所降低,但并无显著性差异( P>0.05)。与模型对照组比较,中、高剂量组有所升高,但并无显著性差异( P>0.05)。

肝损伤模型对照组与正常对照组相比,酒精可导致模型对照组小鼠肝组织中脂质过氧化产物MDA含量显著升高,存在极显著性差异(P<0.01)。2.2 对酒精肝损伤的辅助保护作用

实验结果显示(见表3),肝损伤模型对照组与正常对照组相比,酒精可导致模型对照组小鼠血清中 ALT 和 AST活性升高,存在显著性差异(P< 0.01,P<0.05)。与模型对照组比较,各剂量组血清ALT和AST活性均有降低,但无显著性差异( P> 0.05)。

肝损伤模型对照组与正常对照组相比,酒精可使模型对照组小鼠血清 TG水平显著上升(P< 0.01)。与模型对照组比较,葛根复方饮料中剂量可明显降低肝组织TG含量(P<0.05)。

实验结果显示(见表4),肝损伤模型对照组与正常对照组相比,酒精可导致模型对照组小鼠肝组织中脂质过氧化产物MDA含量显著升高,存在极显著性差异(P<0.01)。与模型对照组比较,中剂量组可显著降低小鼠肝组织MDA含量(P<0.05)。

实验结果(见表 4)显示,肝损伤模型对照组与正常对照组相比,酒精可导致模型对照组小鼠肝组

GSH-织中SOD和 px活性显著降低,存在显著性差异(P<0.01,P<0.05)。与模型对照组比较,各剂量

GSH-组小鼠肝组织SOD、 px活性均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。2.3 复方葛根饮料对小鼠肝脏病理组织学的影响

各实验组切片统计结果见表5。正常对照组小鼠(见图1a)肝组织结构整齐,胞浆内几乎不存在脂肪滴;模型对照组肝细胞(见图1b)大多发生严重的气球样变和透明性变,胞核周围聚集着大量的大泡性脂肪滴。模型对照组(图1b)与正常对照组(图1a)比较,肝脏脂肪细胞变性评分在统计学上有显著性差异(P<0.01),该动物试验模型成立,成功复制出了实验小鼠酒精性肝损伤模型。从镜检上看,各剂量组与模型组相比较(见图1c、图1d、图1e),肝细胞脂肪变性程度减轻,但统计学上无显著性差异(P> 0.05)。

各组病理组织学检查图片见图1,依次为正常对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。3 结论本试验研究治疗性给药后小鼠血清ALT、AST

图1 各组病理组织学检查图片

活性以及肝细胞TG、MDA含量,与模型对照组比较,复方葛根饮料各剂量组均可降低小鼠血清ALT活性以及肝组织MDA含量,复方葛根饮料高剂量组可明显降低小鼠血清AST活性,表明其对急性酒精中毒引起的肝损伤有一定的修复作用;中、高剂量组可明显降低肝组织TG含量(P<0.01),表明肝脏脂质化有明显改善。

本试验研究长期给予受试物对酒精性肝损伤的辅助保护作用,与模型对照组比较,复方葛根饮料各剂量组均可降低小鼠血清ALT、AST活性,肝

GSH-组织SOD、 px活性均有升高;中剂量可明显降低肝组织TG含量(P<0.05)及显著降低小鼠肝组织MDA含量(P<0.05),表明从氧化应激方面看,复方葛根饮料可提高肝组织的抗氧化能力,降低自由基的产生,从而减轻氧化应激导致的肝损伤。从肝脏病理切片镜检上看,与模型组相比较,各剂量组肝细胞脂肪变性程度均有一定程度的减轻。参考文献: [1] 李欣.全球葡萄酒及烈酒市场发展展望[J].中国食品, 2013(7): 50- 53. [2] 杨明亮,尹章汉,吴炎忠,等.饮酒与健康[J].中国卫生监196-督杂志,2002,9(4): 201. [3] 方芳,王凤忠.醉酒与解酒的研究[J].农产品加工(学刊), 59- 2013,22: 61. [4] 许耀宗.酒精性中毒患者应用中药葛根治疗的药效与药理研究[J].北方药学,2016(2): 108- 109. [5] 嵇扬,李俊,杨平.枳椇子对急性酒精中毒的作用[J].中药材,2001(2): 126- 128. [6] 齐越,秦杰,邱坤鹏,等.枸杞茶饮联合综合护理对非酒精性脂肪肝临床研究[J].现代生物医学进展,2014(3): 560-

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d中剂量组

e 高剂量组

c 低剂量组

a正常对照组

b模型对照组

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