Study on Nucleoside-Producing Fungus Isolated from Yanghe Daqu

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LI Guoyou1, CHEN Xiang2, MI Jiao1, YANG Yong2, YANG Tao1, ZHOU Xinhu2, TANG Jialin1, ZHUANG Mingyang1 and WU Linwei1 (1.Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu, Sichuan 610041; 2.Yanghe Distillery Co. Ltd., Suqian, Jiangsu 223800, China) Abstract: A nucleoside- producing fungus strain was isolated from Yanghe Daqu by using spread plate and streaking. On the basis of morphological and molecular analysis, it was identified as Lichtheimia ramosa. HPLC analysis showed that Lichtheimia ramosa could produce adenosine and uridine with diverse bioactivities. This study laid the foundation for the application of nucleoside- producing fungus in Baijiu production. Key words: microbe; Daqu; mycelial fungus; Lichtheimia ramosa; ITS; nucleoside

大曲是酿造名优白酒及独特风味白酒的基础之一[ 1],在白酒酿造过程中起着重要作用。大曲中的微生物种类多种多样,且相互作用,功能微生物能够代谢产生各种结构类型丰富,生物活性显著的次级代谢产物。因此,大曲不仅是白酒酿造功能微生物群的载体,也是香味及前驱物质的来源,更是白酒健康功能因子的源泉,其对白酒的品质具有十

[ 3]分重要的影响 2- 。前期,我们首次从江苏洋河酒厂的大曲中分离得到了能产腺苷、尿苷等核苷类活性化合物的丝状真菌,该类次级代谢产物具有免疫调节、改善脑细胞代谢、镇静中枢神经等广泛的药

[4]理生理活性 。腺苷是一种遍布人体细胞且具有重要生理功能的内源性物质[ 5],是人体循环系统疾病 的药物[ 6];在临床上可直接作为心血管和循环系统

[7]疾病的药物,能促进冠状血管扩张和血管生成、增加毛细血管的密度[ 8- 9],能缓解炎症,具有抗炎作用[ 10],同时也是多种抗病毒药物合成的中间体;尿苷具有治疗肝病和心脑血管疾病的功能。目前核苷类化合物已作为药品、保健品和食品添加剂得到了广泛的应用。

随着人们健康意识的增强,饮用健康白酒的理念越来越深入人心,开发具有良好生理活性的健康型白酒是中国白酒的必然发展趋势,因此从大曲中发现能够代谢产生健康功能因子的功能菌,并将其应用到健康白酒的酿造中,对于促进中国白酒的健康发展具有十分重要的意义。本实验采用涂布法、

划线法等传统微生物分离纯化的方法,对洋河大曲中能够代谢产生核苷健康功能因子的菌进行了分离、筛选和鉴定,获得了1株能够产核苷类活性化合物的丝状真菌,利用形态和分子生物学相结合的方法对其进行了鉴定。在此,本文对该菌的分离纯化和分子鉴定工作进行报道,该研究为洋河大曲核苷功能菌开发应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器1.1.1 材料大曲样取自江苏洋河酒厂股份有限公司。1.1.2 仪器SW- CJ高效液相色谱(上海伍丰色谱仪), 1FD洁净工作台(苏净集团苏州泰安空气技术有限DH-公司), 600型电热恒温培养箱(北京中兴伟业DZKW-仪器有限公司), 4电子恒温水浴锅(北京SHZ-中兴伟业仪器有限公司), D循环水式真空泵PCWJ- (巩义市予华仪器有限责任公司), 20超纯DL-水机(成都品成科技有限公司), 1万用电炉(北BH-京中兴伟业仪器有限公司), 2型光学显微镜TG16- ( OLYMPUS), W微量高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发公司), PCR仪( Eppendorf Thermal Bio- Cycler),电泳仪( Rad)。1.1.3 试剂-真菌平板分离培养基:马丁 孟加拉红培养基,葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,K2HPO4 1 g,MgSO4 · 7H2O 0.5 g,孟加拉红 33.4 mg,卡那霉素20 mg,琼脂15 g,纯水1000 mL,121 ℃灭菌20 min。发酵培养基:麸皮10 g,葡萄糖0.2 g,纯水7.5 mL, 121 ℃灭菌30 min。标品:腺嘌呤核苷,鸟嘌呤核甘,胸腺嘧啶核甘。1.2 试验方法1.2.1 菌种分离在超净工作台中粉碎曲块,取10 g大曲中心部位样品加入装有90 mL无菌水的三角瓶中,在培养箱中以150 r/min、室温振荡30 min。再进行逐级稀释,取合适稀释倍数的菌悬液在真菌分离培养基上 进行平板涂布。然后将平板置于温度为30 ℃的培养箱中培养。经过适当的培养时间,选择菌落形态有明显差异的菌株分离、纯化和保藏。1.2.2 菌种筛选

真菌以30 ℃静置培养15 d。发酵完成后,加入 100 mL 70 % vol 乙醇,在 60 ℃条件下水浴4 h,再将提取液过滤,提取2次,合并滤液,减压浓缩获得浸膏。所得浸膏各取20 mg,加入1 mL超纯水,滤膜过滤, HPLC分析(分析条件:检测波长258 nm;柱温30 ℃;流量0.8 mL/min;甲醇/水梯度洗脱: 0~ 30 min,0 %~25 %)。1.2.3 菌种鉴定1.2.3.1 菌种形态、生化鉴定

真菌菌落形态鉴定:以无菌操作,分别将经融化并冷却到45 ℃左右的PDA培养基倾注于培养皿中,培养基凝固后即成平板。从菌株斜面上挑取少量孢子点到上述平板适当位置,30 ℃倒置培养,观察菌落形态。

真菌显微形态观察:采用湿室载片培养法,在培养皿底部铺一张略小于皿底的圆滤纸片,再放1U个 形玻棒,其上入一块洁净载玻片和2块盖玻片,盖上皿盖,包扎后以121 ℃灭菌30 min,烘干备用。取已灭菌的PDA培养基6~7 mL注入另一灭菌平皿中,使之凝固成薄层。用解剖针切取0.5~ 1 cm的琼脂块,并将其移至上述培养室中的载玻片上。用尖细的接种针挑取少量孢子接种于琼脂块的边缘上,用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。在平皿的滤纸上加3~5 mL灭菌的20 %甘油,盖上皿盖,30 ℃培养。一定培养时间后取出载玻片,在光学显微镜下观察显微形态。1.2.3.2 菌种分子鉴定真菌采用ITS[ 序列分析的方法对菌种进行鉴11]

5'-定 ,真 菌 通 用 引 物 ITS1 ( TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 5'-

3') 和 IST4 ( TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3') 用于真菌 ITS 序列的扩增。

μL, PCR扩增体系为:模板DNA 2 引物1和引物2

μL, μL, μL,各 1 10×PCR 缓冲液 2.5 Hifi 酶 0.5

μL, μL dNTP 2 无菌超纯水16 。PCR反应程序为: 94 ℃预变性4 min后进行32个循环,每个循环包括

94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,最后一个循环72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。 2 结果与讨论2.1 菌株筛选

累积分离得到 71 株菌,其中细菌 31 株,真菌40株。通过高效液相( HPLC)技术对分离菌株发酵产物进行分析,最终筛选得到1株产核苷类化合物的菌株(图1和图2),鉴定为横梗霉( Lichtheimia ramosa YH2.3.4)。 2.2 菌种鉴定结果2.2.1 菌种形态鉴定结果

Lichtheimia ramosa YH2.3.4型态观察结果:菌落生长迅速,初为白色,后为灰白色,反面无色,有假根,孢囊梗由生假根处的匍匐菌丝生出,分枝或不分枝,顶端膨大成中轴基,孢子囊半球形或球形,孢囊孢子多呈球形(图3)。2.2.2 菌种分子鉴定结果

将扩增过的DNA片段进行测序,测序结果在 NCBI的Genbank数据库中进行BLASTN同源性比对,根据相似度鉴定出菌株的种属,再结合形态学结果,将该菌鉴定为横梗霉( Lichtheimia ramosa)。横梗霉ITS测序结果: 5’-

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGAGGTCTAAAAAACCACTAGTTGGGGGT CTCTTCCCCTCTAGTAGTTCCTCACAGTTTTGT GCAAAGTCGGGTCAACTTGGTTGGCTCTGCCT TGTGCTGTAGATCTGGTTGTTGGCATAGAGACC CTCCTTTTAGGAGACTTGTGCCACTACTAAGAT CTAGGCTGCTTGAAAAGAGACGTATGGACCCT TCTTTCAGGAGACCTATGTCTCGAGTCAAAGC AAGCAAGGCAAGCCTTTGGGGCTCTAGTACTA ACTATCCCCAAAGGTGTTTATTCTTCTCGTGTA AACCATGATGTACGAAAAAGTTAGTTGTTAAC TTAAAAACAACTCTTGGCAATGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAAGTGCG ATAATTATTGCGACTTGCATTCATAGCGAATCAT CGAGTTCTCGAACGCATCTTGCGCCTAGTAGT CAATCTACTAGGCACAGTTGTTTCAGTATCTGC AACTACCAATCAGTTCAACTTGGTTCTTTGAAC CTAAGCGAGCTGGAAATGGGCTTGTGTTGATG GCATTCAGTTGCTGTCATGGCCTTAAATACATT TAGTCCTAGGCAATTGGCTTTAGTCATTTGCCG GATGTAGACTCTAGAGTGCCTGAGGAGCAACG ACTTGGTTAGTGAGTTCATAATTCCAAGTCAAT CAGTCTCTTCTTGAACTAGGTCTTAATCTTTAC

GGACTAGCGAGAGGATCTAACTTGGGTCTTCT CTTAAACAAACTCATATCTAGATCTGAAATCAA CTGAGATCACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA-

3’

3 讨论

本实验首次从洋河成品大曲中分离得到1株可以代谢产生腺苷、尿苷活性成分的功能性微生物,并利用分子生物学的技术将其鉴定为横梗霉。本研究为洋河大曲中核苷活性功能因子的来源提供了依据,也为洋河大曲核苷功能菌在白酒酿造中的应用奠定了基础。

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图3 横梗霉显微照片

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