Culture of Seed of Rhizopus Bran Starter

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YAN Qimei, SHEN Xiaobo, LI Yanrong and PU Chun (Yanghe Distillery Co. Ltd., Suqian, Jiangsu 223800, China) Abstract: The culture of the seed of Rhizopus bran starter was optimized by single factor test and orthogonal experiments with Rhizopus oryzae Q303 of strong saccharifying power as the strain. The results suggested that, the factors influencing the quality of Rhizopus bran starter ranked in decreasing sequence as moisture content> loading capacity> culture time. The optimum culture conditions were summed up as follows: culture temperature was at 32.5 ℃, culture time was 60 h, loading amount was 15 g/500 mL, and moisture content was 53.3 %(8 mL). This study had provided data support and theoretical guidance for pilot production. Key words: Rhizopus; bran starter; orthogonal

我国使用小曲酿酒的历史久远,而传统小曲中起糖化作用的菌群主要是根霉菌。以麸皮为原料,经纯种固态培养的根霉曲在小曲酒中被广泛应用,与传统小曲比较,根霉曲具有成品质量稳定、用曲量少和原料出酒率高等特点。目前,国内对于根霉

[ 2] [3]的研究主要集中在生物特性 1- 、浅盘工艺 、生产

[4]过程 等,但对于根霉麸曲种曲培养工艺的系统研究鲜有报道。20世纪70年代末,贵州分离诱变出了性能优良的根霉菌种Q303,属台湾根霉,产酸少,糖化力强,出酒率优于常用的AS3.851,适合于酿制甜酒和不同原料的小曲酒。本研究以根霉Q303为例,对种曲培养工艺进行系统的研究,以期为中试生产提供数据支撑。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂及仪器菌种:根霉Q303,购买于贵州省酿酒工程技术开发中心;麸皮:市售。试剂及耗材:葡萄糖、浓盐酸、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾等。SW- CJ-仪器设备: 1A标准型净化工作台,无DNP-锡深蓝科技有限公司; 9162型电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;立式压力蒸汽灭YXQ-LS-菌锅, 75S11型,上海博讯实业有限公司;控温水浴锅,南通华泰实验仪器有限公司;台式低速离心机, AXTD5A型,盐城市安信实验仪器有限-公司;电子天平, AL204型,梅特勒 拖利多仪器(上

海)有限公司; MILLPORE 超纯水系统。1.2 检测方法

试饭糖分与试饭酸度的测定参照文献[ 1,3,5],有改动。

试饭测定方法如下:( 1)蒸饭:取大米20 g,米水比为1∶1.6,加水拌匀于罐头瓶,121 ℃蒸饭10 min。要求饭粒熟而不烂,米饭含水量57 %左右。( 2)培菌糖化:米饭凉至35 ℃左右,拌入米饭重量 0.8 %的根霉麸曲种曲,拌匀后于30 ℃培养箱中培养24 h后,测定其试饭糖分与酸度。( 3)试饭糖分的处理:取糖化饭10 g 于 250 mL磨口三角瓶,加蒸馏水100 mL,57 ℃水浴1 h,取出,迅速冷却,离心(3 min、3500 r/min)。( 4)测定:采用快速法,测定时取离心液 0.5 mL进行测定,此时试饭糖分的计算公式如下: ( =(V0 - V) ×C × × 100试饭糖分%) 100 0.5 10 V0- =2( V)×C式中: V0——斐林试剂溶液的标定值( mL); V——斐林试剂溶液的测定值( mL); C——标准葡萄糖溶液浓度( g/L); 100/0.5——0.5为测定时所取溶液的体积( mL),100为糖化饭浸出液的体积( mL); 100/10——10为所取糖化饭重量( g),100为换算成100 g糖化饭中的糖分( g)。试饭酸度是指中和每克糖化饭所消耗0.1 mol/L NaOH溶液的毫升数。其测定方法为:取上述离心液10 mL(相当于1g糖化饭),以酚酞为指示剂,用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至红色,按下式计算试饭酸度:试饭酸度( %)=M×V×100/10。M——注: NaOH溶液的浓度( mol/L); V——滴定消耗NaOH溶液的体积( mL)。1.3 种曲培养工艺称取麸皮,加水适量,充分拌匀,灭菌后冷却,接入一定量的二级菌种,放入培养箱培养一段时间,烘干,检测试饭糖分和试饭酸度。1.4 单因素试验设计培养温度:按上述工艺,称取15 g麸皮于500 mL三角瓶内,加7 mL水(水分含量为46.7 %)拌匀,接 种后将种曲分别放入30 ℃、32.5 ℃、35 ℃培养箱中培养48 h,检测试饭糖分与酸度。

培养时间:按培养温度工艺,将种曲放入32.5 ℃培养箱中分别培养24 h、36 h、48 h、60 h、72 h,检测试饭糖分与酸度。

装载量:装载量分别按10 g/500 mL、15 g/500 mL、20 g/500 mL、25 g/500 mL、30 g/500 mL称取麸皮,水分按照7 mL水/15 g麸皮的比例加水分别为4.7 mL、7.0 mL、9.3 mL、11.7 mL、14.0 mL拌匀,将种曲放入32.5 ℃培养箱培养60 h,检测试饭糖分与酸度。

水分含量:按装载量20 g/500 mL称取麸皮,水分按6 mL水/15 g麸皮( 40.0 %)、水7 mL /15 g麸皮( 46.7 %)、水8 m /15 g麸皮( 53.3 %)、水9 mL /15 g麸皮( 60.0 %)、10 mL水/15 g麸皮( 66.7 %)的比例加水拌匀,将种曲放入 32.5 ℃培养箱中培养60 h,检测试饭糖分与酸度。1.5 正交试验设计

在单因素试验基础上,采用L9 ( 34)正交表对培养时间、装载量、水分含量进行优化,见表1。

表1 正交试验因子与水平 图1 培养温度对根霉麸曲质量的影响[据文献 1-2],根霉的最适温度在30~35 ℃之间,本试验选择30 ℃、32.5 ℃、35 ℃共3个水平研究温

度对根霉麸曲质量的影响(见图1)。随着温度的升高,试饭糖分呈递增趋势。当培养温度为32.5 ℃,根霉的试饭糖分为 21.96 %,比30 ℃的试饭糖分高6.2 %,仅比35 ℃试饭糖分低2.9 %。从外观看,35 ℃培养的麸曲曲质偏黑,并且温度越高麸曲异味越大。随着温度的升高,试饭酸度先增大后降低,32.5 ℃时根霉的试饭酸度最高且小于0.5 %,符合根霉麸曲质量要求 。所以,根霉麸曲

[5]培养温度选择32.5 ℃。2.1.2 培养时间对根霉麸曲质量的影响(图2)

随着培养时间的延长,试饭糖分先增大后降低趋于稳定。当培养时间为48 h时,试饭糖分最高22.96 %;当培养时间为72 h,试饭糖分为20.88 %,比36 h的试饭糖分高28 %。试饭酸度随着培养时间的延长呈现先增后降再升的趋势,且总体试饭酸度数值小于0.5 %。故在正交试验中选取培养时间48~72 h进行工艺优化。2.1.3 装载量对根霉麸曲质量的影响(图3) 研究装载量对根霉麸曲质量的影响,结果表明,随着装载量的增加,根霉麸曲的试饭糖分先增 加后降低。当装载量为20 g/500 mL时,试饭糖分最大,为24.54 %;当装载量为10 g/500 mL时,试饭糖分为23 %,由于装载量小,随着培养时间的延长,麸皮水分过快干结,达不到根霉麸曲的生长环境;当装载量为30 g/500 mL时,试饭糖分为22.92 %,根霉是需氧型微生物,装载量大,不能满足其最适生长条件,容易滋生杂菌。根霉的试饭酸度随着装载量的增大,呈现先降后升的趋势,装载量越大(大于30 g/500 mL),试饭酸度越大,可能是氧气不足,根霉得不到更好的生长。故装载量选取15~25 g/500 mL进行工艺优化。2.1.4 水分含量对根霉麸曲质量的影响(图4)

由图4可以看出,随着麸皮含水量的增加,根霉麸曲的试饭糖分先增大后降低趋于稳定。水分含量为40 %时,不适于根霉的生长;水分含量为53.3 %时,试饭糖分最大。根霉的试饭酸度随水分含量的增加无规律可循,但总体数值小于 0.5 %。当水分含量为66.7 %时,根霉的试饭糖分比60 %水分含量的试饭糖分低1.2 %,根霉的试饭酸度达到最大值,并且麸曲结饼程度很紧实,可能是麸皮含水量过大,麸曲生长过快,不利于通气和散热,也不利于后期中试接种使用。故在正交试验中选取46.7 %~60.0 %进行优化设计。2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验结果,在培养温度32.5 ℃条件下,以根霉麸曲的试饭糖分为指标,按表1进行正交试验。由表2正交试验优化结果表明:各因素对根霉麸曲质量的影响程度为C2>B1>A1,即水分含量>装载量>培养时间,根霉麸曲种曲最佳培养工

艺条件为A1B1C2:培养温度32.5 ℃、培养时间48 h、装载量15 g/500 mL、水分含量 53.3 %(8 mL)。正交试验结果表明,最好的工艺组合为A2B1C2,即培养温度32.5 ℃、培养时间60 h、装载量15 g/500 mL、水分含量53.3 %(8 mL),此工艺条件的试饭糖分为27.33 %。2.3 验证试验

正交试验得到的根霉麸曲种曲最佳培养工艺条件A1B1C2:培养温度32.5 ℃、培养时间48 h、装载量15 g/500 mL、水分含量 53.3 %(8 mL)。正交试验结果中最好的工艺A2B1C2:培养温度32.5 ℃、培养时间60 h、装载量15 g/500 mL、水分含量 53.3 % ( 8 mL)。两种工艺结合制作三角瓶种曲。

由表3验证试验结果可知,根霉麸曲种曲最佳培养工艺为 A2B1C2,此时根霉的试饭糖分为28.01 %,比A1B1C2的试饭糖分高3.4 %。 3 结论

通过单因素和正交试验优化了根霉麸曲种曲培养工艺,试验结果表明,影响根霉麸曲质量的因素依次为水分含量>装载量>培养时间。水分含量是影响麸曲质量的重要因素,水分含量低,麸皮干结过快,不能满足根霉的生长环境,水分高,麸曲 结饼程度很紧实,供氧和散热不足,易滋生杂菌。比较验证了正交试验优化的工艺和正交试验结果中最好的工艺对根霉麸曲质量的影响,根霉麸曲种曲最佳培养工艺条件为培养温度32.5 ℃、培养时间60 h、装载量15 g/500 mL、水分含量53.3 %(8 mL),为中试生产提供有力的数据支撑和理论指导。

参考文献:

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