UPLC-MS/MS方法在葡萄酒花色苷鉴定过程中对两种锦葵色素同分异构体的分离

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王昶森1,2,杨志伟1,刘亚新1,张 昂1,金 刚2,王 飞1,张进杰1 ( 1.秦皇岛出入境检验检疫局技术中心,河北秦皇岛 066004; 2.宁夏大学葡萄酒学院,宁夏银川 750021) UPLC-摘要: 在使用 MS/MS方法探究葡萄酒中存在的花色苷种类的过程中发现锦葵色素有两种形态的同分异构体,这两种物质的性质极为相似,无法轻易的区分,本文就区分这两种物质的方法展开了UPLC-讨论与试验,最终敲定了使用 MS/MS区分这两种同分异构体的仪器条件以及试验方法。UPLC-关键词: 葡萄酒; MS/MS; 花色苷; 同分异构体1001- 06-0072-中图分类号: TS262.6;TS261.4;TS261.7 文献标识码: A 文章编号: 9286(2018) 04

Identification of Two Malvidin Isomers by UPLC-MS/MS in the Determination of Anthocyanins in Grape Wine

WANG Changsen1,2, YANG Zhiwei1, LIU Yaxin1, ZHANG Ang1, JIN Gang2, WANG Fei1 and ZHANG Jinjie1 (1.Technique Centre of Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao, Hebei 066004; 2.School of Wine, Ningxia University, Yinchuan, Ningxia 750021, China) Abstract: During the exploration process of anthocyanins in grape wine by UPLC- MS/MS, 2 malvidin isomers were found. Their properties were extremely similar, so they were hard to distinguish. In this paper, we discussed the methods for distinguishing the 2 isomers. Finally, the use of UPLC-MS/MS, as well as the related instruments and technical parameters were determined. Key words: wine; UPLC-MS/MS; anthocyanin; isomer 多酚化合物是存在于葡萄果皮上的一类重要的次生代谢产物。这类物质随着葡萄果实的破碎、压榨和发酵等处理进入葡萄酒中,进而对葡萄酒的品质特征产生影响。作为功能性物质,花色苷不仅影响葡萄酒的色泽,而且可通过与其他物质的结[1]合,影响葡萄酒质量的稳定性 。花色苷常以糖苷形式存在,是由花色素与葡萄[2]糖相结合而生成的糖苷类化合物 。花色苷的结构可以分为四大类:基本花色苷、酰化花色苷、吡喃花[ 6]色苷、聚合花色苷 3- 。基本花色苷主要有5种形 式:飞燕草花色素苷、锦葵花色素苷、芍药花色素苷、矢车菊花色素苷和矮牵牛花色素苷。花色苷作为葡萄酒主要呈色物质,使其呈现出不同颜色,对葡萄酒的感官品质起到决定性作用。葡萄中,花色苷主要存在于红色、紫色葡萄浆果皮中最靠近表皮3~4层细胞的液泡中 。葡萄酒中花色苷的组成

[7]特征蕴含了产地、品种、年份以及酿酒工艺等信息,此外,栽培方式、生态条件、陈酿时间等因素都能不

[ 9]同程度地影响花色苷8- 。葡萄酒中花色苷物质的组成和含量主要取决于葡萄品种,可作为区分不同

品种红葡萄酒的化学标志。

除此之外,花色苷还有抗氧化的作用,且针对老年病有着特殊的功效,在预防老年痴呆,抗糖尿病,保护血管、动脉,抗高血压,抗炎,抗突变肿瘤、癌症等方面效果显著。

因此,分析葡萄及葡萄酒中花色苷尤显重要。但是在探索过程中发现锦葵色素产生了两种同分

3- 3- β异构体,即锦葵色素 O半乳糖苷和锦葵色素葡萄糖苷,这两种物质极性相似、性质相似,用其他花色苷的区分方法无法分离。所以建立了新的方法探讨这两种花色苷同分异构体的分离。

两种花色苷同分异构体的信息见图1和图2。 MS/MS系统相比较于其他液质仪器其主要特点

QJet-有: (1)创新的 2离子导入技术:极大地提高了系统的灵敏度,改善了真空的分配; (2)创新的弯曲LINAC碰撞室:提高了离子传输速度,增加了离子容量,同时有效地防止交叉污染,改善了质谱数据质量; (3)创新的Q3线性加速技术:极大地提高了

- MRMMS/MS扫描能力; (4)独特的“杆 阱扫描” ( IDA-

EPI )方式:可以建立高质量的EPI质谱库; (5)创新的AcQuRate脉冲离子计数检测器:确保系统的重现性和精确性; (6)创新的eQ电子学设计:确保进行快速扫描和快速正负切换扫描; (7)专利的气帘气接口技术:降低了污染,提高工作效率; (8)Turbo V离子源:这是常规应用的高性能离子源,可适应范围的液相流速要求,有效防止电喷雾的离子抑制现象,具有自清洁探头的功能; (9)最新版 Analyst 1.5软件提供了最新的定量分析工具包,而且具

s-有智能化的 MRM数据采集模式。 1 材料与方法1.1 材料、试剂及仪器葡萄酒:长城四星干红葡萄酒(Great Wall FourStar Red, Shacheng, China)。试剂及耗材:三氟乙酸、甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯, Fisher (Fairlawn,NJ,USA)公司;锦葵色素3- 3- β O半乳糖苷和锦葵色素 葡萄糖苷,标准品纯度大于 99.5 %,Extrasynthese SA (Genay,France)公司。®仪器: AB Sciex QTRAP 5500 LC/MS/MS 系统,美国AB公司;去离子水机。 1.2 试验方法1.2.1 标准品的稀释

将标准品拆封后根据说明书的浓度显示使用含5%甲酸的甲醇溶液稀释至1 ppm装瓶、充氮、密封、冷藏待用。1.2.2 优化质谱条件

将配制好的标准品稀释至1 ppb用移液枪移至进样瓶,进入质谱仪优化Q1、Q3、DP、CE、CXP等参数,质谱参数见表1。1.2.3 样品的制备

取部分酒样,用含5%乙腈的 0.1 %三氟乙酸稀释 500 倍,涡旋混合后用移液枪转移1 mL至进样瓶。1.2.4 进样准备

第一次进样:分别将两种标准品稀释至1 ppb,分别进样,随后两种标准品混合至1 mL进样。

第二次进样:将两种标准品等量与酒样混合至1 mL进样。1.2.5 色谱条件ODS色谱柱(C18柱) ,美国安捷伦公司(250 mm×

μm); 4.6 mm,5 流动相A:0.1 %三氟乙酸水溶液,流动相B:乙腈。洗脱程序: 0~0.5 min,0 %~5 % B; 0.5~0.6 min,5 %~15 % B;0.6~2.5 min,15 % B; 2.5~2.6 min,15 %~18 % B;2.6~5 min,18 % B; 5~5.5 min,18 %~5 % B;5.5~8 min,5 %~0 % B。柱温: 30 ℃;检测波长: 525 nm;波长扫描范

μL围: 200~900 nm;进样量: 30 。质谱采用电雾喷离子源(ESI),正离子模式,离子扫描范围: 100~ 1000 m/z;喷化器压力: 35 psi;干燥气流速: 10 L/min;干燥气温度: 350 ℃。每个样品重复进样2次。梯度洗脱程序见图3。

2 结果与分析

3- 3- β锦葵色素 O半乳糖苷和锦葵色素 葡萄 3-图4 锦葵色素 O半乳糖苷和3- β锦葵色素 葡萄糖苷出峰图糖苷出峰图见图4。由图4可看出,使用这种方法和梯度洗脱可以将两种同分异构体分离,与第一次3-进样的图对比可知,混标中1号峰为锦葵色素 O 3- β半乳糖苷,2号峰为锦葵色素 葡萄糖苷,所以第二次进样即可分辨两种花色苷,此方法可应用于鉴别葡萄酒中是否含这两种花色苷,并区分。在建立方法后,使用该方法对一批酒样进行了检测,验证了方法的普遍性。结果见表2。3-经检验可知,葡萄酒中的锦葵色素 O半乳糖苷含量较高且在整体花色苷中所占比例也较大,而3- β作为其同分异构体的锦葵色素 葡萄糖苷含量3-较少。所以两种物质可以主要考虑锦葵色素 O半乳糖苷。 3

结论

本方法的优势在于:

UPLC- (1)利用 MS/MS的方法对葡萄酒两种花色苷进行了分离, 试验方法有很好的重复性,分离效果好,两种花色苷的峰图有较好的峰型以及分离度。该方法可以作为两种同分异构体的区分方法。

(2)对两种葡萄酒花色苷进行了分析, 并建立了参考模型。参考模型从图形和数据上反映出不同花色苷的差别,两种花色苷可以通过特征峰的响应值和保留时间区别。(3)与前人的研究方法对花色苷的研究方法比

UPLC-较, 本研究使用了更为先进的 MS/MS方法,完整地比较出峰的特征,不需要对葡萄酒中的物质进行鉴定和定量测定,大大简化了分析操作。

(4)初步建立两种葡萄酒花色苷UPLC 出峰图谱数据库, 对同分异构体花色苷进行了很好的区

分。继续对此数据库的完善,可以更有效地鉴别更多性质相似的花色苷。

但是该方法只能测定酒样里有无花色苷及其含量,无法鉴定花色苷在酒中起的影响和性质,所以该实验方法尚需改进。

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