Preliminary Study of Antioxidant Activity of Yellow Water

ZHANG Fuyong, SU Jian, LIU Yang and AN Mingzhe (Wuliangye Distillery Co. Ltd., Yibin, Sichuan 644000, China)

Liquor-Making Science and Technology - - Contents - ZHANG Fuyong et al(

Abstract: In order to explore the antioxidant activity distribution of yellow water, yellow water was separated into crude polysaccharide and yellow liquid on the basis of the determination of DPPH scavenging activity and total antioxidant activity of yellow water. The results suggested that, yellow liquid was the main contributor to the antioxidant activity of yellow water. DPPH scavenging activity of yellow water was 55.7 %, and its inhibiting percentage was 63.8 %. DPPH scavenging activity of crude polysaccharide was 18.1 %, and its inhibiting percentage was 31.3 %. DPPH scavenging activity of yellow liquid was 31 %, its inhibiting percentage was 38.9 %, and its total phenolic was 480 mg/L. Key words: yellow water; antioxidant activity; DPPH; crude polysaccharide; total phenolic

浓香型白酒生产过程中,入窖发酵糟醅的含水量为52 %~55 %,随着发酵的进行,糟醅中的营养物质在微生物和酶的作用下分解转化,生成的水与糟醅中原有的水分沉积、汇聚于窖池底部,发酵结束后起糟操作时,通过打坑、开槽将水分渗出,采用泵或者人工舀出,此类液体一般呈黄褐色,生产上称为黄水。黄水中通常含有1 %~2 %的残余淀粉,0.3 %~0.7 %的残糖,4 %~5 %的乙醇,以及有机酸、白酒香味成分及前体物质等,具有较高的利

[1]用价值 。

目前对黄水的研究大多局限在呈香呈味物质 的提取利用,尚未有对黄水抗氧化活性及相关物质的报道。众所周知,国内外对葡萄酒、黄酒和啤酒的抗氧化活性及功能性物质的研究常有报道。目前国内对白酒的抗氧化活性及健康因子的研究日益趋热,但因白酒属于蒸馏酒,蒸馏导致白酒抗氧

[2]化活性较低、白酒中抗氧化物质含量较少 。本研究通过利用DPPH自由基清除法及总抗氧化测定对黄水的抗氧化活性进行测定,对初步分离得到的黄水粗多糖及黄水清液进行抗氧化活性测定,探索黄水抗氧化活性的分布。为今后进一步资源化利用黄水中的抗氧化活性物质提供思路。

1 材料与方法 1.1 材料与设备

黄水、浓香型白酒,五粮液酒厂;黄酒,绍兴产1,1- -黄酒;没食子酸、维生素C,国药集团; 二苯基2- Folin-三硝基苯肼( DPPH)、 酚试剂,美国 sigma公司。离心机5810R、分光光度计,美国 Eppendorf 公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化厂;冷冻干燥仪,德国德蒙christ冷冻干燥机。 1.2 方法1.2.1 黄水DPPH自由基清除能力的测定[3]参照沈赤等 的方法,配制 0.1 mmol/L 的DPPH自由基溶液、1 g/L的维生素C、没食子酸溶液,避光4 ℃保存,现配现用。空白比色管中加入μL 2 mL超纯水,100 待测样品,混匀。最后向上述体系中准确加入2 mL DPPH自由基溶液,充分混匀。于室温避光静置30 min后,在 517 nm处测定吸光值变化。用1 g/L没食子酸和维生素C作为阳性对照,白酒和黄酒作为参照。按下式计算清除1-率:清除率( %)=( A1/A0)×100 ;其中: A1为待测样存在时的吸光度; A0为对照样的吸光度。1.2.2 黄水总抗氧化能力的测定[4]参照王晓宇等 使用的亚油酸体系,准确量取2.5 mL K3PO4缓冲液( 0.04 mol/L,pH7.0)和 2.5 mL亚油酸乳状液于5 mL比色管中,混匀。向上述体μL系中加入200 待测样,充分混匀。将混合反应液μL,放入37 ℃培养箱中避光培养,每12 h取样100共取5次。用硫氰酸盐法检测反应体系的氧化程μL度。检测方法:取样品溶液100 加入到4.7 mL乙μL醇( 75 %vol)中,然后加入100 硫氰酸铵( 30 %) μL和100 FeCl (浓度为20 mmol/2L,溶于3.5 % HCl中)混匀,在500 nm处测定吸光值变化。用2.5 mL的 K3PO4缓冲液与2.5 mL的亚油酸乳状液混合作空白对照,用1 g/L Vc、没食子酸作为阳性对照,用白酒和黄酒作为参照。按下式计算氧化抑制百分率:氧化抑制率1- ( %)=( A1/A0)×100;其中: A1为待测酒样存在时的吸光度; A0为对照样的吸光度。 1.2.3 黄水粗多糖的制备及抗氧化活性测定黄水粗多糖的制备参照绍兴黄酒多糖提取的[5]方法 并进行改进,取400 mL新鲜黄水进行减压浓缩、浓缩至 100 mL(即浓缩比为4.0),乙醇浓度为80 % vol、醇沉时间为24 h、醇沉温度为4 ℃,离心收集多糖,将收集得到的粗多糖进行冻干,计算黄水粗多糖得率;将得到的黄水粗多糖用去离子水还原至400 mL,并测定其DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力。1.2.4 黄水除多糖后清液(醇沉液)的抗氧化活性及总酚测定

对醇沉离心后所得的上清液进行减压浓缩、挥发去除用于醇沉的乙醇,将上清液体积控制在100 mL左右,并用去离子水还原至黄水原体积( 400 mL)即为黄水清液,测定其DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力,同时测定黄水清液中总酚的含量,总

Folin-酚测定采用 Ciocalteu法测定 。

[6] 2 结果与分析

2.1 黄水DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种以氮为中心的有机自由基,其性质稳定、呈深紫色,在 517 nm处的吸收较强。当抗氧化物质提供的电子与DPPH电子配对时,溶液颜色变浅,517 nm处的吸收消失,反映了自由基被清除的情况,其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系。因此,可以较迅速地评价物质的抗氧化能力。测定结果如图1所示:在相同条件

μL下,100 Vc、没食子酸、白酒、黄酒和黄水对DPPH 的清除率分别是 65.4 %、78.0 %、9.2 %、43.7 %、55.7 %。结果表明,黄水的DPPH自由基清除能力较强甚至强于黄酒,但白酒的DPPH自由基清除能力较弱。这与文献报道的DPPH自由基清

[7]除率为“啤酒>葡萄酒>黄酒>白酒”基本一致 。2.2 总抗氧化能力

总抗氧化能力是通过样品对亚油酸的自氧化作用的抑制来测定的。在亚油酸的自氧化过程中,会产生过氧化物。这些过氧化物会将Fe2+氧化为Fe3+,Fe3+与 SCN-形成络合物,于 500 nm处有最大吸光值。因此,吸光值越高,表明亚油酸自氧化的

程度越高。加入待测样品后,通过硫氰酸盐法测定的亚油酸自氧化程度的吸光值。测定结果如图2

μL所示: 100 Vc、没食子酸、白酒、黄酒和黄水,反应时间为 60 h 时,氧化抑制率分别为 76.7 %、90.1 %、10.3 %、45.6 %、63.8 %。结果表明,亚油酸体系测定的上述样品氧化抑制率普遍高于DPPH自由基清除率,且氧化抑制率强弱程度与DPPH自由基清除率相一致。同时表现出黄水的抗氧化能力较强,甚至强于黄酒,明显高于白酒,也与现有研

[8]究发现的黄酒氧化抑制率 为60 %~99 %相一致。 2.3 黄水粗多糖的制备及抗氧化活性测定参照绍兴黄酒多糖提取的方法并进行改进:浓缩比为4.0,乙醇浓度为80 %vol、醇沉时间为24 h、醇沉温度为4 ℃,离心收集多糖,400 mL新鲜黄水经醇沉提取、冷冻干燥后得到 1.64 g黄水粗多糖,得率为0.41 %。将冻干的黄水粗多糖用去离子水再溶至400 mL后测得的抗氧化能力如图3所示:黄水粗多糖的DPPH自由基清除率为18.1 %、氧化抑制率为31.3 %,这说明经过醇沉得到的黄水粗多糖在功能上类似于植物多糖,但抗氧化能力仍略低于

文献报道的绍兴黄酒多糖200 mg/L的53 %氧化抑制率。可以在后续的试验中对黄水粗多糖进行浓缩、精制,进一步研究提升黄水多糖的抗氧化功效。 2.4 黄水除多糖后清液(醇沉液)的抗氧化活性及总酚测定

对醇沉离心后所得的上清液进行减压浓缩、挥发除去加入的乙醇,将上清液体积控制在 100 mL左右,并还原至黄水体积( 400 mL)制备成黄水清液,测定其 DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力,结果见图4。黄水清液的DPPH自由基清除率达到31 %、氧化抑制率为38.9 %,较高于黄水粗多

Folin糖,具有较为明显的抗氧化能力。同时采用Ciocalteu法测定清液中总酚的含量为480 mg/L,接近于相关文献报道的黄酒总酚含量400~900 mg/L,进一步印证了黄水清液的抗氧化能力。 2.5 黄水抗氧化能力的分布通过减压浓缩、醇沉多糖等操作将新鲜黄水分离成黄水粗多糖和黄水清液两个组分,分别对两个组分进行再溶、还原至原黄水体积以便更为直观的与原黄水对比,两组分与黄水的DPPH自由基清除效果及总抗氧化能力如图5所示。黄水的抗氧化

活性在黄水粗多糖及黄水清液中均有分布和体现,但主要分布于黄水清液中。造成黄水抗氧化活性分布特性原因主要与白酒的生产方式有关,白酒生产一般采用以单粮或多粮为原料,利用酒曲中的多种微生物共同作用,经陈年泥窖长期发酵而成。原料中未被利用的多糖、维生素类、酚类等化合物以及长期缺氧发酵代谢过程中产生的微生物多糖、还原性物质等,这些物质依附于糟醅进入水相环境,由于不易挥发从而被保留在黄水中。实验中测定的黄水粗多糖及总酚可以说明黄水的抗氧化能力,但是其他存在于黄水中的抗氧化物质,如氨基酸、小分子肽类、烯萜类也有可能具有抗氧化作用,具体成分尚待进一步研究,为拓宽白酒抗氧化活性物质、提升白酒健康功效提供支撑。

3 结论

通过DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力两种指标间接测定黄水及分离的黄水两大组分。研 究结果表明,黄水中含有的组分具有明显强于白酒的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力,蒸馏是导致白酒抗氧化能力偏低的主要原因,表明具有抗氧化活性的物质难以挥发;黄水的抗氧化活性物质主要分布在黄水清液中,但黄水多糖仍有一定的抗氧化能力。初步推测,酚类化合物是引起黄水抗氧化活性的主要物质,然而由于黄水经过长时间缺氧发酵其成分极为复杂、存在多种类型的还原性物质,具体是哪一种抗氧化活性成分、哪些是可以高效利用,尚待今后进一步的深入研究。

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图2 黄水及参照物的总抗氧化力

图4 黄水清液抗氧化能力

图3 黄水粗多糖抗氧化能力

图1 黄水及参照物的DPPH自由基清除率

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