双氢青蒿素通过调控MAPK/PI3K/Akt信号通路抗结直肠癌作用研究Research of dihydroartemisinin on anti⁃colorectal cancer by regulating MAPK/PI3K/Akt signaling pathway

徐嘉若1，2，3，贾丰菁1，陈佳靓1，姚广涛1

1.上海中医药大学（上海 201203）；2.四川省药品检验研究院，四川省医疗器械检测中心（四川 成都 611731）；3.国家药品监督管理局药物制剂体内外相关性技术研究重点实验室（四川 成都 611731）

【摘 要】 目的：探讨双氢青蒿素（ DHA）在体内对人结直肠癌（ RKO）细胞的抗癌活性及体外机制。方法：将只40 SPF级雄性裸鼠建立 RKO荷瘤小鼠模型，随机分为模型组、顺铂组及DHA 高剂量（ 200 mg/kg）、低剂量（ 100 mg/kg）组，每组 10 只；对比各组裸鼠体质量、肿瘤体积、肿瘤质量、抑瘤率、血清肿瘤坏死因子（ TNF-α）水平等；苏木素-伊红（ HE）染色观察各组裸鼠肿瘤组织病理学变化；噻唑蓝（ MTT）比色法检测不同浓度（ 25、50、100 μmol/L）DHA 干预 0、24、48、72 h 内对 RKO细胞增殖的影响；流式细胞仪、Hoechst 33258 检测（ 0、50、95、150 μmol/L）DHA 干预 48 h 后对RKO 细胞周期和细胞凋亡的影响；划痕实验观察 95 μmol/L DHA 干预对细胞迁移能力的影响；实时荧光定量 PCR （ RT-qPCR）检测 DHA 对细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶- 3（ Caspase-3）、Caspase-9、B 细胞淋巴瘤- 2（ Bcl-2）、Bcl-2相关 X 蛋白（ Bax） mRNA表达水平的影响；蛋白质印迹法（ Western blot）检测 DHA 对细胞内 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 以及 p38-丝裂原活化蛋白激酶（ p38-MAPK）、p-p38-MAPK、磷脂酰肌醇 3-激酶（ PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶 B （ Akt）、p-Akt、基质金属蛋白酶（ MMP-9）等表达水平的影响。结果： 200 mg/kg DHA显著降低肿瘤体积和质量，降低血清 TNF- α 水平，抑瘤率为 41.45%；DHA 可随浓度的增加而增强对 RKO 细胞增殖的抑制作用；（ 50、95、150 μmol/L） DHA 阻滞 RKO 细胞周期在 G2/M 期，且促进 RKO 细胞凋亡作用随 DHA浓度增加而增强； 95 μmol/L DHA 干预 12、24 h 后可显著降低 RKO细胞迁移能力（ P< 0.01）；95 μmol/L DHA 可显著上调 RKO 细胞内 Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表达水平（ P< 0.01）以及 Bax/Bcl-2 mRNA 表达比值（ P< 0.05）；95 μmol/L DHA 可增加 RKO 细胞内剪切型Caspase-9（cleaved-Caspase-9）/Caspase-9、Bax/Bcl-2 蛋白表达（ P< 0.01），同时降低 MMP-9、p-P38 MAPK、p-PI3K、p-Akt及 Akt 蛋白表达水平（ P< 0.01）。结论： DHA有较好的抑制结直肠癌作用，其机制可能为抑制 MAPK/PI3K/Akt 信号通路，触发 RKO细胞内源性凋亡，阻止其增殖与迁移。

【关键词】 双氢青蒿素；结直肠癌； RKO 细胞；细胞凋亡； MAPK/PI3K/Akt 信号通路

XU Jiaruo1，2，3，JIA Fengjing1，CHEN Jialiang1，YAO Guangtao1

1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China； 2. Sichuan Pharmaceutical Inspection and Research Institue，Sichuan Medical Device Testing Center，Chengdu 611731，Sichuan，China；3. NMPA Key laboratory for Research on in Vitro-in Vivo Correlation Technology of Pharmaceutical Preparations，Chengdu 611731，Sichuan，China

ABSTRACT Objective： To investigate the anticancer activity of dihydroartemisinin（DHA）on RKO cells in vivo and its mechanism in vitro. Methods： 40 RKO tumor-bearing mouse models were established in specific pathogen-free male nude mice and randomly divided into model group，cisplatin group，high dose DHA（200 mg/kg）group，and low dose DHA（100 mg/kg）group，with 10 mice in each group. The body weight，tumor volume，tumor mass，tumor inhibition rate and serum，tumor necrosis factor- α（TNF- α）level of each group were

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（ 82003641）；国家科技重大专项（ 2019ZX09201004-002）；上海市教委预算内项目（ 18LK019）

［作者简介］ 徐嘉若，女，在读硕士生，主要从事中药新药及药理学研究

［通信作者］ 姚广涛，副研究员，硕士生导师； E-mail：yaoguangyao1969@126.com。陈佳靓，工程师； E-mail：409786396@qq.com收稿日期： 2023-07-02；修回日期： 2023-09-19

compared. Hematoxylin-eosin （ H&E）staining was used to observe tumor histopathological changes in nude mice of each group. MTT assay was used to detect the effects of DHA at different concentrations（25，50，100 μmol/L）on the proliferation of RKO cells within 0，24，48，and 72 h. Flow cytometry and Hoechst 33258 were used to detect the effects of DHA （ 0，50，95，150 μmol/L）on the cell cycle and apoptosis of RKO cells after 48 h intervention. Wound healing assay was used to observe the effect of 95 μmol/L DHA on cell migration. Real Time Quantitative PCR （ RT-qPCR） was used to detect the effect of DHA on the mRNA expression levels of Caspase-3，Caspase-9，Bcl-2 and

Bax. Western blot was used to detect the effect of DHA on the expression levels of Caspase-3，Caspase-9，Bcl-2，Bax，p38-MAPK，p-p38MAPK，PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt and MMP-9. Results： Tumor volume and mass were significantly reduced and the serum level of TNFα was lowered by 200 mg/kg DHA，and the tumor inhibition rate was 41.45%. The inhibitory effect on RKO cell proliferation was enhanced with increasing concentration of DHA. RKO cell cycle was arrested in the G2/M phase by （ 50，95，150 μmol/L）DHA，and the effect of promoting RKO cell apoptosis was enhanced with the increase of DHA concentration. The migration ability of RKO cells was significantly reduced after intervention with 95 μmol/L DHA for 12 and 24 h （ P< 0.01）. The mRNA expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 in RKO cells were significantly up-regulated by 95 μmol/L DHA（ P< 0.01），and Bax/Bcl-2 mRNA expression ratio was also significantly upregulated（ P< 0.05）. The protein expressions of cleaved-Caspase-9/Caspase-9 and Bax/Bcl-2 in RKO cells were increased by 95 μmol/L DHA （ P< 0.01），while the protein expression levels of MMP-9，p-P38 MAPK，p-PI3K，p-Akt and Akt were decreased（P<0.01）. Conclusion： DHA has a good inhibitory effect on colorectal cancer，and its mechanism may be to trigger the endogenous apoptosis of RKO cells to prevent their proliferation and migration through inhibiting the MAPK/PI3K/Akt signaling pathway.

KEYWORDS dihydroartemisinin；colorectal cancer；RKO cells；cell apoptosis；MAPK/PI3K/Akt signaling pathway

结直肠癌（ colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤，近年来发展极为迅速，具有较高的发病率和致死率，且易复发、易转移 CRC 治疗

［］ 1 。根据指南，目前手术和辅助化疗是主要的治疗选择，尤其是对于晚期 CRC患者，手术治疗有复发和转移的风险，以及腹泻或便秘等手术后遗症。化疗药物如顺铂（ DDP）是抗癌谱广、作用强的细胞周期非特异性化疗药物。作为一种铂类金属络合物，其通过干扰细胞内 DNA 的复制和转录或结合核蛋白及包浆蛋白来发挥抗癌作用，是联合化疗中最常用的药物［］ 2-3 。但因其对正常细胞也会产生毒性以及多种严重副作用，导致其广泛应用受到了限制，因此为抑制 CRC的疾病发展，预防肿瘤扩散和复发，开发研究新作用机制、低毒性的抗肿瘤药物成为关注焦点。

中医学的辨证论治、治未病、多靶点治疗等特点，为中药治疗恶性肿瘤提供了一种新的思路与方法［］ 4 ，越来越多的学者开始关注天然药物在肿瘤领域的临床研究。20 世纪 80 年代，屠呦呦团队从中草药青蒿中分离提取出一种低毒且具有抗疟作用的环状倍半萜类化合物青蒿素，经考证只有黄花蒿中含有该成分。黄花蒿（ Artemisia annua L.）系《中华人民共和国药典（ 2020 年版）》所载“青蒿”的基源植物，味苦、辛，性寒，归肝、胆经；可清热解暑，除蒸、截疟。东晋葛洪《肘后备急方》中记载青蒿治疗疟疾：“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。”青蒿素及其衍生物除抗疟疾作用外，也表现出有效的抗癌活性［］。

双氢青蒿素（ dihydroartemisinin，DHA）因其在多种恶性肿瘤中发挥的抗肿瘤作用被广泛研究，能克服青蒿素复燃率高、在油中和水中溶解度低、难以制成合适剂型等缺点。但目前针对 DHA 治疗结直肠癌的作用及调节机制仍未得到充分的研究数据证实。已有的研究显示， DHA可能通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）/细胞周期蛋白 B1细胞周期蛋白 B1（CCNB1）/Polo 样激酶 1（PLK1） 、

［］ 6 Toll 样受体 4（TLR4） 、蛋白激酶 B（Akt）/雷帕霉素

［］ 7

靶蛋白（ mTOR） 、线粒体内膜自噬受体（ PHB2）

［］ 8

RCHY 等信号通路来抑制 CRC的肿瘤发生和周期

［］ 9

进展。在本研究中，课题组采用了 RKO 细胞系评估了 DHA对皮下移植瘤的抑制作用，并探讨 DHA在 CRC治疗中的作用分子机制，以期为 DHA 在CRC治疗中的应用提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性裸鼠 40 只， 6~7 周龄，体质量为 23~26 g，购自于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物生产许可证号： SCXK（沪） 20180006；饲养地为上海中医药大学实验动物中心，许可证： SYXK（沪） 2014-0008。所有涉及的实验方案均通过上海中医药大学伦理委员会批准（伦理编号： PZSHOTCM201113011），实验动物均在标准无菌条件下饲养，温度20 ℃~25 ℃，湿度 40%-60%，光照 12 h

明 12 h 暗。

1.1.2 细胞 人结直肠癌 RKO 细胞，购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。RKO细胞株培养采用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素试液的 RPMI-1640 培养基，置于 37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.1.3 药物与试剂 DHA 由上海交通大学张万斌课题组合成并惠赠，纯度>99%。

顺铂（ 25 mg/支，货号： P4394）美国 Sigma 公司，使用前使用 0.9% NaCl 溶液配制成 0.2 mg/mL 浓度的溶液，超声助溶， 4℃存放。

噻唑蓝（ MTT）试剂（批号： ST316）、Hoechst 33258 染色液（批号： C0003），上海碧云天生物技术有限公司； Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（批号： MA0220）、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（批号： MA0334），大连美仑生物技术有限公司； RNA提取试剂盒（批号： CW2020M）、逆转录试剂盒（批号： CW3008M），康为世纪生物技术有限公司； Elisa试剂盒（ TNF-α）（货号： EMC102a.96），新博盛生物科技有限公司。

兔抗基质金属蛋白酶- 9（MMP-9）抗体（批号：

13667）、兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（ Caspase）-3 抗体（批号： 14220）、兔抗 Caspase-9 抗体（批号： 9508）、兔抗剪切型 Caspase-3 抗体（ cleaved Caspase-3，批号： 9661）、兔 抗 剪 切 型Caspase-9 抗体（ cleaved Caspase-9，批号： 7237）、兔抗 B淋巴细胞瘤- 2 基因（ Bcl-2）抗体（批号： 5023）、兔抗 Bcl-2 相关 X 蛋白（ Bax）抗体（批号： 4223）、兔抗磷脂酰肌醇- 3-激酶（ PI3K）抗体（批号： 4257）、兔抗蛋白激酶 B（Akt）抗体（批号： 4691）、兔抗磷酸化PI3K（p-PI3K）抗体（批号： 4228）、兔抗 p-Akt 抗体（批号： 4060）以及 β-actin 抗体（批号： 3700）、兔抗p38丝裂原活化蛋白激酶（ p38 MAPK）抗体（批号： 8690）、兔抗 p-p38 MAPK 抗体（批号： 4511），美国

Cell Signaling Technology 公司。

1.1.4 主要仪器 Forma 3110 系列水套式细胞培养箱、1300 系列Ⅱ级 A2 型生物安全柜、Sorvall ST16R 冷冻离心机、Multiskan 多功能酶标仪，美国

Thermo Fisher Scientific 公司；流式细胞仪，美国Beckman 公司； QuantStudio 6 Flex 型实时荧光定量PCR 仪，美国 ABI 公司； N-SIM 型超分辨率显微镜，日本 Nikon 公司； PowerPac 型电泳系统、转膜仪，美国 Bio-Rad 公司； C600型多功能分子成像系统，美国 Azure Biosystems 公司；电子数显游标卡尺，中国高致精密仪器。

1.2 RKO荷瘤小鼠皮下移植瘤模型

1.2.1 动物分组与造模方法 取对数生长期的RKO 细胞，将细胞悬液（ 1×107个/mL）以体积 0.2 mL/只接种于裸鼠左侧腋窝皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。模型建立后，待肿瘤直径≥5 mm 时将裸鼠随机分为模型组、顺铂组及 DHA高剂量组、低剂量组，每组各 10只。模型组每天给予 0.2 mL 0.9% NaCl 溶液灌胃，顺铂组腹腔注射 0.2 mg/kg 顺铂，隔天给药， DHA 高、低剂量组分别给予 200、100 mg/kg DHA 灌胃， 1 次/d。各组均连续给药 30 d。

1.2.2 观察指标 ①裸鼠生长指标记录各组裸鼠给药干预前后体质量变化，用电子游标卡尺测量并记录移植瘤的长径（ L）和横径（ W），计算肿瘤体积，公式为瘤体积（ V， mm3）= ［ L（ mm）×W2（mm2） ］ /2，绘制移植瘤生长曲线图； ②第 31 天停止药物干预并对裸鼠进行取血。剥取出裸鼠皮下移植瘤称重，计算不同分组的肿瘤抑制率，公式为抑瘤率（ %）=（1-平

DHA/

均瘤质量 平均瘤质量模型组） ×100%。③苏木素-伊红（ HE）染色观察各组裸鼠肿瘤组织病理变化。④酶联免疫吸附剂测定（ ELISA）检测各组裸鼠血清中 TNF-α 分泌水平。

1.3 MTT 检测细胞增殖 将 RKO 细胞以 1×104个/孔的密度接种到96孔板上，待贴壁后分别加入0、25、50、100 μmol/L DHA，于不同时间点（ 0、12、24、48、72 h）每孔加入 20 μL MTT 溶液（ 0.5 mg/mL），37 ℃孵育 4h后去除培养液，每孔加入 150 μL DMSO，避光振荡 10 min，在酶标仪 570 nm处测定吸光度（ OD）。1.4 流式细胞术及 Hoechst 33258 染色检测细胞周期与细胞凋亡 将 RKO 细胞以 2.5×104 个/孔的密度接种到 6孔板上，采用不同浓度（ 0、50、95、150 μmol/L）DHA 处理 48 h，细胞周期与凋亡检测按照细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、PI/Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒和 Hoechst 33258 染色说明书进行，采用流式细胞仪分析细胞周期分布，荧光显微镜拍摄细胞凋亡情况。

1.5 划痕实验检测细胞迁移 将 RKO 细胞接种在

6 孔板上（ 5×106 个/孔），待细胞长满后进行划痕，分别用 0、95 μmol/L DHA 处理，于 0、6、12、24 h时显微镜下拍照，采用 ImageJ 软件测定空白区域面积，计算细胞迁移率。

1.6 荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测相关基因表

达通过将、TRIzol 0 95提取总μmol/L RNA； DHA逆转录制备处理 12 h cDNA；后的 RKO以 β-actin细胞为内参，荧光定量 PCR 检测各组细胞中 Caspase-3、Caspase-9、、Bcl-2 Bax mRNA 表达水平。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，见表1。反应条件： 95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共循环 45 次。溶解曲线分析： 95 ℃，15 s；60 ℃， 1 min；95 ℃，15 s；50 ℃，30 s。采用 2− ΔΔCT 值表示

1.7表达胞用蛋RIPA将、白0免裂解法提取总蛋白， 95疫印μmol/L迹法（ DHA Western处理BCA blot） 48 h检测相关蛋白法检测蛋白浓后的 RKO 细度。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，牛奶封闭 2h。一抗抗体稀释 1 000 倍， 4℃ 5%孵育过脱脂5夜。次日先用000倍稀释的TBST二抗，室洗膜温下3 次，摇床10上min/孵育次2 ；后h；加再用入TBST 洗膜 3 次， 10 min/次；按 ECL试剂盒说明，与凝胶成像系统内进行曝光显影。采用 ImageJ 图像分析管理系统对蛋白条带进行定量分析。

1.8 统计学方法 采用 SPSS 16.0 软件进行数据统计分析，采用 GraphPad 9.0 软件进行绘图。计量资料以 x ˉ ± s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以LSD- t 检验进行多重比较。当 P< 0.05 时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对 RKO荷瘤裸鼠生长状况的影响 裸鼠接种RKO细胞第 9天左右，小鼠皮下成瘤且移植瘤直径≥5 mm。给药期间与模型组相比，顺铂组裸鼠精神状态萎靡，反应迟缓，进食量较小； DHA 高、低剂

量组裸鼠精神状态良好，较为活跃，正常进食。给药 30 d 后，与模型组比较，顺铂组裸鼠体质量明显下降（ P< 0.01），而 DHA 低剂量组裸鼠体质量上升（ P< 0.05）；与顺铂组裸鼠比较， DHA 高、低剂量组裸鼠体质量明显上升（ P< 0.01）。

表2 各组裸鼠体质量变化（ n= 10，± x ˉ s）

Tab. 2 Changes of body mass of nudemice in each group （ n= 10，± x ˉ s）

组别

体质量（ g）

给药前给药后

模型组23.67±1.32 30.08±1.52

顺铂组23.63±1.05 26.61±1.55**

DHA 低剂量组24.82±0.69 32.08±1.33*##

DHA 高剂量组24.81±1.18 31.17±2.17##注：与模型组比较， * P< 0.05，** P< 0.01；与顺铂组比较， ## P< 0.01。

2.2 对 RKO 移植瘤生长的影响 根据测量记录各组裸鼠移植瘤的体积，绘制 RKO 移植瘤生长曲线，见图 1（B）。第 31天处理裸鼠，剥出肿瘤组织称重并计算抑瘤率，见图 1（A 和 C）、表 3。给药治疗后，与模型组比较，顺铂组和 DHA 高剂量组能明显抑制肿瘤体积（ P< 0.05， P< 0.01）。按照公式计算给药后各组裸鼠的抑瘤率，顺铂组抑瘤率为 60.80%，DHA高剂量组为 41.45%，而 DHA 低剂量组对 RKO 移植瘤无抑制作用。

2.3 各组裸鼠肿瘤免疫组织化学染色切片 为进一步明确 DHA对肿瘤生长的抑制作用，采用 HE

染色对肿瘤细胞进行病理分析。病理结果显示，模型组肿瘤细胞呈巢状生长，分化程度低且可观察到大量核分裂象，见图 2（A）；顺铂组肿瘤细胞呈巢状生长，且肿瘤细胞灶内可见坏死，与模型组相比肿瘤细胞较小，见图 2（B）；DHA 低剂量组肿瘤细胞呈巢状生长且可见核分裂象，分化程度低，有少量坏死，见图 2（C）；DHA 高剂量组肿瘤细胞呈巢状生长，且细胞灶内可见大量坏死凋亡，见图 2（D）。从 HE 染色结果可见， DHA 抑制了 RKO 移植瘤的生长并诱导肿瘤细胞凋亡。

2.4 对血清中 TNF- α 分泌水平的影响 采用ELISA 检测各组裸鼠外周血中 TNF-α 含量，结果显示，与模型组比较，顺铂组血清中 TNF- α 水平差异无统计学意义（ P> 0.05），而 DHA 高、低剂量组可明显降低 TNF- α 含量，差异具有显著性（ P< 0.05， P< 0.01），且对 TNF- α 水平的抑制作用较顺铂组更为

AB、 为模型组， CD、 为顺铂组， EF、 为 DHA 低剂量组， GH、 为 DHA高剂量组。

图 2 各组 RKO荷瘤裸鼠肿瘤病理形态变化（ HE 染色）

Fig. 2 Pathological changes of tumors in RKO tumorbearing mice of each group （ HE staining）

与模型组比较， * P< 0.05，** P< 0.01；与顺铂组比较， # P< 0.05，## P< 0.01。n= 10，± x ˉ s。

图 3 各组裸鼠血清中 TNF-α 分泌水平的变化Fig. 3 Changes in TNF-α secretion levels in serum of mice in each group

间可增强 DHA 对 RKO 细胞生长的抑制作用。

2.6 对 RKO细胞周期与凋亡的影响 通过流式细胞仪进行检测分析经不同浓度 DHA 干预的 RKO细胞，结果表明不同浓度 DHA 对 RKO 细胞周期有明显的影响，能阻滞细胞周期于 G2/M 期，且对 RKO细胞周期的阻滞程度随DHA浓度的增加而加强（ P<

A为等比例浓度梯度DHA 对 RKO 细胞的 IC50；B 为不同浓度 DHA 分别作用 0、12、24、48、72 h 对 RKO细胞增殖的抑制作用。n= 5，± x ˉ s。

图 4 DHA 对 RKO细胞增殖的影响

Fig. 4 Effect of DHA on proliferation of RKO cells 0.01），如图 5（A 和 B）所示，集聚体（绿色）和细胞碎片（蓝色）占比增加，表明凋亡细胞数量增加，证明DHA 可以抑制 RKO 细胞增殖并诱导其凋亡。

采用流式细胞术检测分析经 Annexin V-FITC/ PI染色处理的不同浓度（ 0、50、95、150 μmol/L）DHA对 RKO 细胞凋亡的影响，见图 5（C 和 D）。结果表明，与 0 μmol/L DHA 组比较， DHA 对 RKO 细胞的促凋亡作用，随着药物浓度的增加而增强（ P< 0.01）。

同时，本课题组采用 Hoechst 33258 荧光染料对 DHA 处理后的 RKO 细胞进行染色，如图 5（E）荧光显微镜下观察到的 RKO细胞凋亡情况所示，随着加入的 DHA 浓度增加，凋亡的 RKO 细胞荧光强度逐渐加深，细胞数量逐渐减少，甚至在高浓度（ 150 μmol/L）DHA 处理下， RKO 细胞核发生破裂，标记的荧光颜色发白。

2.7 DHA 对 RKO 细胞迁移能力的影响 采用划痕实验观察 95 μmol/L DHA 处理不同时间点（ 06、、12、对24 h） RKO 细胞迁移能力的影响以进一步证实 DHA 的抗 CRC 活性。如图 6（A 和 B）所示，与对照组（ 0 μmol/L DHA）比较， 6h 时 95 μmol/L DHA对 RKO细胞迁移能力影响无显著性（ P> 0.05），但干预 12、24 h 后， 95 μmol/L DHA 可抑制 RKO 细胞活力，显著抑制 RKO细胞的迁移能力（ P< 0.01）。同时，经 95 μmol/L DHA 干预 48 h 后可抑制 RKO 细胞中 MMP-9 的表达（ P< 0.05）。

2.8 DHA 对 RKO 细胞凋亡相关基因 mRNA 转录水平的影响 本课题组采用 RT-qPCR 检测了Caspase级联激活反应，以更好地阐明 DHA 诱导RKO 细胞凋亡的可能机制。内源性凋亡通路相关的调控因子大多定位于线粒体中，主要通过调节Bcl-2蛋白家族来控制线粒体膜的通透性，调控Cyt C的释放。释放的细胞色素 C（Cyt C）与凋亡蛋白酶活化因子（ Apaf-1）、pro-Caspase-9 结合形成“凋亡体”，进而激活执行因子 Caspase-3，造成 DNA 断裂和核固缩，最终引起细胞凋亡［ 10-11 ］。结果如图 7 所示，与对照组（ 0 μmol/L DHA）相比，经 95 μmol/L DHA 干预 12 h 后，显著增加了 RKO 细胞内促凋亡因子 Caspase-3、Caspase-9 mRNA 的表达（ P< 0.05），同时也上调了 Bax/Bcl-2 mRNA的表达比值（ P<

0.01）。

2.9 DHA 对 RKO 细胞凋亡相关蛋白表达的影响图 8（A 和 B）反映了经 DHA 处理后 RKO 细胞内凋亡相关蛋白的表达水平变化。结果表明，与

0 μmol/L DHA比较， 95 μmol/L DHA 干预 48 h 后，显著上调了 RKO 细胞内 cleaved-Caspase-3/Caspase-3 cleaved-Caspase-9/Capase-9、Bax/Bcl-2 蛋白表达水平比值（ P< 0.01）。提示 DHA 干预可能通过触发细胞内源性凋亡通路来诱导 RKO细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。

2.10 DHA 对 MAPK/PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响 采用 Western blot 分析 PI3K、及Akt p38 MAPK 在 DHA 干预的 RKO 细胞作用中的内源性功能。实验结果如图9 所示，与对照组（ 0 μmol/L DHA）比较，经 95 μmol/L DHA 处理后显著降低了Akt 的蛋白表达（ P< 0.05），同时抑制了 p-p38 MAPK、p-Akt（ P< 0.05， P< 0.01）。这些结果表明DHA 对 RKO 细胞的促凋亡和增殖抑制作用与

MAPK/PI3K/Akt 信号转导通路有关。3 讨论在本研究中，本课题组采用了 RKO 细胞系探

A为流式细胞术分析各组细胞周期分布； B为不同浓度 DHA 对 RKO细胞周期分布的影响， C为流式细胞术检测细胞凋亡； D为各组细胞凋亡率； E 为 Hoechst 33258 染色观察各组细胞凋亡情况（ 40×）。与 0 μmol/L 比较， ** P< 0.01；与 50 μmol/L 比较， ## P< 0.01；与 95 μmol/L 比较， △△ P< 0.01。n= 3，± x ˉ s。

图 5 DHA 对 RKO细胞周期和凋亡的影响

Fig. 5 Effect of DHA on cell cycle and apoptosis in RKO cells DHA CRC

讨 在 治疗中的作用和分子机制，并在裸DHA鼠中评估了 对皮下移植瘤的抑制作用。结果DHA表明， 可以通过抑制 p-p38 MAPK，调控 PI3K/

Akt 信号通路来诱导 RKO细胞凋亡，抑制肿瘤生

DHA 12长，同时 对正常细胞不会产生毒性作用［］ ，提示 DHA是一种具有良好前景的抗癌药物。通过建立 RKO 裸鼠移植瘤模型，探讨 DHA 对CRC移植瘤的作用，检测分析各组裸鼠给药后外周血中 TNF- α 的表达水平。结果显示 DHA 高剂量200 mg/kg 可发挥抑瘤作用，实体瘤质量显著低于模

A为显微镜观察 95 μmol/L DHA处理不同时间后 RKO 细胞迁移情况（ 4×）；B 为用 ImageJ 计算各组细胞迁移率； C 为 Western blot 分析 DHA干预 48 h 后 RKO 细胞中 MMP-9 蛋白表达水平。与0 μmol/L DHA 组比较， * P< 0.05，** P< 0.01。n= 3，± x ˉ s。

图 6 DHA 对 RKO细胞迁移能力的影响

Fig. 6 Effect of DHA on the migration ability of RKO cells

与 0 μmol/L DHA 组比较， * P< 0.05，** P< 0.01。n= 3，± x ˉ s。

图 7 DHA 对 RKO细胞凋亡相关基因 mRNA 转录水平的影响

Fig. 7 Effect of DHA on mRNA transcript levels of apoptosis-related genes in RKO cells

型组与低剂量组（ P< 0.05），抑瘤率为 41.45%，对应的顺铂组抑瘤率为 60.80%。此外，测量给药前后裸鼠体质量及皮下肿瘤体积生长变化结果表明，顺铂组与 DHA高剂量组可明显抑制移植瘤生长，但顺铂组裸鼠体质量及生长状态明显下降。另一方面，炎症及免疫反应在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用，研究采用 ELISA 检测各组裸鼠外周血中

TNF- α 水平，发现双氢青蒿素高、低剂量组可明显降低 TNF-α 含量，且对 TNF-α 水平的抑制作用较顺铂组更为显著（ P< 0.05）。

肿瘤坏死因子- α（TNF-α）是一种由巨噬细胞产生的、涉及系统性炎症的细胞因子，主要调节中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞。作为一个特别的且具有多重功能的细胞因子， TNF- α在不同的细胞微环境中可诱导多种反应，如诱导细胞凋亡、坏死、血管生成、细胞迁移、分化等。当 TNF-α 与肿瘤坏死因子受体（ TNFR）结合时会产生一系列协同反应激活NF⁃κB 信号通路，而 NF-κB 转录因子会诱导凋亡抑

与 0 μmol/L DHA 组比较， ** P< 0.01。n= 3，± x ˉ s。

图 8 DHA 对 RKO细胞凋亡相关蛋白表达情况

Fig. 8 Expression of apoptosis-related proteins in RKO cells treated with DHA

与 0 μmol/L DHA 组比较， * P< 0.05，** P< 0.01。n= 3，± x ˉ s。图 9 DHA 对 RKO 细胞 MAPK/PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达的影响

Fig. 9 Expression of MAPK/PI3K/Akt signaling pathway related proteins in RKO cells of each group瘤细胞凋亡，导致肿瘤的增殖、生长、侵袭及转移［］ 13 。制因子的表达，从而抑制译、增殖、生长和存活等多种细胞基本生物功能，在PI3K/Akt 与 MAPK 信号通路参与调节转录、翻Caspase 的活化，阻碍了肿维持蛋白质合成、促进增殖和抑制凋亡方面发挥重要作用，因此该通路的异常激活可导致肿瘤的发生和发展［ 14-15 ］。PI3K 是一种特异性催化磷脂酰肌醇

的物质，磷脂酰肌醇主要由其调节亚基 P85 和催化亚基 P110 组成。根据催化亚基 P110 及其相关底物的不同，可分为亚基ⅠⅡⅢ、 、 。Ⅰ型 PI3K 研究表明，磷脂酰肌醇 PIP2 的质膜中激活 PI3K 二磷酸功能，然后转化为 PIP3，作为第二信使与 Akt 结合转移［］ 16 。Akt 存在于一个包含 p38 MAPK、激酶活化

蛋白激酶 2（MK2）和热休克蛋白 27（Hsp27）的信号复合物中， p38 MAPK 依赖的 MK2 激活在人中性粒2（PDK2）细胞中发挥丙酮酸脱氢酶激酶同工酶 的作用，可以调节 Akt 的活性，在 p-Akt ［］ 17 中发挥重要作用。当 Akt的结构发生变化时，磷酸化 PDK1、PDK2及其相关基因位点，最终激活 Akt 调控细胞增殖、凋亡和分化。活化的 Akt 可激活 Bcl-2、Caspase 和 FOXOs的磷酸化，进而通过一系列抗凋亡作用促进癌细胞的生存［ 18-19 ］。实验结果发现95 μmol/L DHA干预后上调了RKO细胞内 Caspase-3、Caspase-9、Bax/Bcl-2 水平，触发细胞内源性凋亡通路，同时明显降低 RKO 细胞中 Akt 蛋白表达，显著抑制 p38 MAPK、PI3K、Akt 的磷酸化。在划痕实验中本课题组观察到 DHA 可以抑制 RKO 细胞活力，显著降低 RKO 细胞的迁移率（ P< 0.01），Western blot结果分析也证实 DHA 干预后， RKO 细胞内 MMP-9蛋白表达降低（ P< 0.05）。MMP-9 已被证明可以降解细胞外基质（ ECM）和基底膜，促进癌细胞转移和血管生成［］ 20 。MMP-9 是 PI3K/Akt 通路下游的主要