ACTA Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis
呼出气 VOCS在上呼吸道感染病患与健康人间的异同
王珏 郑云昊 刘兆荣 等
1. 北京大学环境科学与工程学院, 北京 100871; 2. 北京大学第三医院感染疾病科, 北京 100191; † 通信作者, E-mail: zrliu@pku.edu.cn
摘要 研究健康人与病患呼出气VOCS成分的异同, 为上呼吸道感染分型的无创快速诊断提供信息。采集60例上呼吸道感染患者、30例健康人呼出气, 利用GC-MS定量检测97种VOCS, 分析健康人及病患呼出气中烷烃、烯烃、卤代烃、含氧烃、芳香烃等物质的分布特点, 并利用ANOVA-PCA, 分析室内空气以及健康人和病患呼出气中VOCS的异同。结果表明, 异戊二烯浓度在病患、健康人呼出气及室内空气中均有显著差异(P<0.05), 且呈现病人>健康人>室内空气的特点; 正戊烷浓度在病患组显著高于健康人组(P<0.05); 丙醛浓度在细菌性上感组显著高于健康组(P=0.019)。PCA分析结果显示, 健康人与上呼吸道感染病患呼出气差异明显, 不同类型病患呼出气VOCS没有明显差异。关键词 呼出气VOCS; 上呼吸道感染; 健康人; ANOVA-PCA中图分类号 X132; R562
Differences in Exhaled VOCS from Patients with Upper Respiratory Tract Infection and Healthy Ones WANG Jue1, ZHENG Yunhao1, LIU Zhaorong1,†, YAO Maosheng1, LI Xiaoguang2, ZHUANG Jia1, PENG Wangyuan1 1. College of Environmental Science and Engineering, Peking University, Beijing 100871; 2. Department of Infectious Diseases, Peking University Third Hospital, Beijing 100191; † Corresponding author, E-mail: zrliu@pku.edu.cn
Abstract Analysis of exhaled VOCS from health and patients may help building association between VOCS and different diseases condition, which could offer a possibility of noninvasive monitoring of disease. VOCS were collected in 30 healthy subjects and 60 patients with upper respiratory tract infection. Analysis of 97 VOCS was performed by gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS). The concentration of alkanes, alkenes, halogenated hydrocarbon, oxygenated hydrocarbons and aromatic hydrocarbons in health and patients breath was analyzed. Analysis of variance (ANOVA), principal component analysis (PCA) were used to analyze the VOC differences from patients and healthy ones. The results show that the concentration of isoprene differ among patients, healthy ones and indoor air (P<0.05). Patients show higher concentration of n-pentane compared to healthy ones (P<0.05). Patients with bacterial upper respiratory tract infection show higher concentration of propanal compared to healthy ones. The results of PCA show that there were significant VOC differences between patients with upper respiratory tract infection and healthy ones (P=0.019), but no differences between bacterial and non-bacterial upper respiratory tract infection. Key words exhaled VOCS; upper respiratory tract infection; healthy; ANOVA-PCA
呼出气中含有多种挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOCS), 能够表征人体的健康状态, 应用于疾病诊断的研究, 优点在于无创、快捷、可重复采样和适用于大规模的疾病筛查。自
[1] Pauling 等 发现人体呼出气内有200多种 VOCS以来, 关于呼出气VOC组分与疾病状态之间关联的研究日益增多, 如在对肺癌、糖尿病、乳腺癌等的研究[2–15]中,通过对比病患与健康人呼出气VOCS成分和浓度水平差异, 可为VOCS疾病诊断模型的建立提供参考。以诊断模型为基础, 基于传感器技术的检测设备能对呼气VOCS进行无创、快速检测[16]。已有研究表明, 利用呼出气VOCS进行临床诊断, 特异性和敏感性均在70%以上[17–19]。
上呼吸道感染(简称上感)是最常见的感染性疾病, 病因复杂多样, 90%由病毒引起, 少数由细菌、
[20–23]衣原体、支原体引起 。细菌性感染与非细菌性感染需要采取不同的治疗措施。细菌性上感需用抗生素治疗, 而抗生素对非细菌性上感无效, 并且会增强致病菌的抗药性[24], 因此上感分型的诊断很重要。目前上感分型诊断最可靠的办法是实验室细菌检测, 但耗时过长, 多用于实验室研究, 不能作为临床诊断方法。因此, 科学家们结合实验室细菌检测结果, 通过对比细菌型上感和非细菌型上感血清中各成分含量差异, 得到有临床诊断意义的指标。研究表明, 中性粒–淋巴细胞比值、血清降钙素元、超敏C反应蛋白、白细胞介素等均有上呼吸道感染临床诊断意义[25–27], 然而, 这些临床诊断不但需要抽血化验, 而且可靠性也存在争议。分析人体呼出气中VOCS在不同健康状态的异同, 可为建立呼出气VOCS与疾病状态之间的联系提供信息,有望为实现呼出气VOCS对上感分型的无创快速诊断提供重要信息。本研究检测健康人、细菌性上感患者、非细菌性上感患者呼出气VOCS浓度, 并通过ANOVAPCA分析, 针对呼出气VOCS在不同健康状态人群的异同进行讨论。
1实验方法1.1样品采集及检测方法
实验人群筛选标准: 上呼吸道感染患者来自某三甲医院发热门诊, 采样时间是2015年12月、2016年4月, 病患是经医生凭临床经验诊断为上呼吸道感染的患者, 主要症状为发热、咳嗽、嗓子痛、头 晕恶心、四肢无力、流鼻涕、有痰等, 剔除有吸烟史、下呼吸道感染病史、重大病史以及空腹时长<2小时的样本, 共得到有效样本60例; 健康样本来自某高校师生, 采样时间是2015年11月, 选择年龄在20~26岁之间、健康状况良好的样本, 剔除一周内有感冒症状、有呼吸道疾病病史以及空腹时长<2小时的样本, 共得到有效样本30例。
样品采集过程: 受试者呼出气在同一房间采集,受试者休息30分钟后, 将冷凝管、5L的Tedlar袋、一次性吹嘴连接, 吹气直到充满Tedlar袋。收集完成后, 立即将Tedlar袋与3 cm长的碱石棉管(吸收CO2)和苏玛罐相连接, 将呼出气转移到苏玛罐中;记录受试者基本信息; 病患受试者还需用咽拭子采集上呼吸道分泌物, 用无菌棉签刮擦咽侧壁及咽后壁, 采集后的咽拭子用于细菌检测。
检测项目及方法: 从某三甲医院发热门诊获得上呼吸道感染病患血检指标, 包括白细胞数、中性粒细胞百分比; 用恒温扩增芯片法对病患呼吸道分泌物中13种常见致病菌(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、耐甲氧西林葡萄球菌、结核分支杆菌复合群)进行多通道芯片检测; 用 GC-MS/FID 分析系统定量检测97种 VOCS。
1.2 质量控制与保证(QA/QC)
为保证冷凝效果, 每采3个样本对冷凝管进行一次清洗晾干, 每天采集一个室内空气样本作为本底对照。所有样本均在48小时内完成检测, GC-MS分析测定的质量控制和保证措施包括质谱调谐、系统标定和日校准。Liu 等[28]对比过本研究系统与台湾中央研究院环境变化研究中心的实验室检测结果, 相同样品的50多种 VOCS 中, 绝大多数偏差都在20%以内, 说明测量方法稳定可靠。
1.3 数据处理方法
病患样本共60例, 根据引发上感的病因不同,分为细菌组和非细菌组, 其中细菌组根据检测方法分为芯片–细菌组和血常规–细菌组。芯片–细菌组:多通道芯片检测结果(1种或多种细菌)为阳性的病患; 血常规–细菌组: 研究表明, 上呼吸道细菌感染病患的白细胞数和中性粒细胞百分比均明显升高,可能是细菌引起的炎症反应所致[29], 因此将芯片检测结果为阴性、血检结果白细胞值高于1.0×1010 L−1