ACTA Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis
Characteristics of Humic Substances in Kbd-affected Region of Changdu, Tibet Based on PARAFAC of Fluorescence
JIANG Yong, GAO Dingxue, MAO Xuewen, et al
1. Key Laboratory for Heavy Metal Pollution Control and Reutilization, School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055; 2. Bureau of Hydrology, Ministry of Water Resources of China, Beijing 100053; 3. China Institute of Water Resources and Hydropower Research, Beijing 100038; 4. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871; † Corresponding author, E-mail: xunan@pkusz.edu.cn
Abstract Humic substances (HS) in Kaschin-beck disease (KBD) affected regions were analyzed based on parallel factor analysis (PARAFAC) of fluorescence. Total organic carbon content of HS did not show significant difference between endemic and disease-free areas. Five fluorescence components were identified with PARAFAC, i.e. component 1 (oxidized quinone-like), component 2 (tryptophan-like), component 3 (terrestrial humic-like), component 4 (reduced quione-like) and component 5 (tyrosine-like). Component 1 (p<0.10), component 4 (p<0.05) of aquatic fulvic acid (FA) and component 4 (p<0.10) of aquatic humic acid (HA) in endemic areas showed higher content than disease-free areas. Lager differences of the quinone redox system in aquatic HS between endemic and disease-free areas exhibited in reduced quinone state than that in oxidized quinone state, and in FA than that in HA. HA showed higher content of reduced quinone than FA, but smaller differences between endemic and disease-free areas for its weaker influence on KBD due to extremely low carbon content in drinking water. Sediment HS showed mutual transformation with aquatic HS and higher content of reduced quinone, but no significant diffe
rences between endemic and disease-free areas. Intensive understanding on the differences of different fractions of HS and different state of quinone between endemic and disease-free areas can help guiding water improvement project in endemic areas. Key words three-dimensional fluorescence spectrum; parallel factor analysis; Kaschin-beck disease (KBD); fulvic acid; humic acid; quinone redox system
大骨节病(Kaschin-beck disease, KBD)是在中国广泛分布的一种地方性流行病, 可导致关节肿大和骨骼变形。20世纪60—80年代间, 该病大范围地流行, 患病人数达到200万[1]。改革开放以来, 随着经济条件的提升, 通过退耕还林(还草)、改水工程和村落迁居等措施, 该病的流行情况减轻, 目前在全国范围内得到控制[2–3]。但其病因尚不明确。通常认为大骨节病是一种多因素导致的疾病, 饮水中的有机物和粮食中的真菌毒素都是大骨节病的致病因素, 其致病机制是其活性含氧基团在有氧条件下产生的氧自由基造成的损伤和异常, 环境低硒则是本病的生物地球化学条件[1,4]。
醌是天然有机质(natural organic matter, NOM)中的主要活性含氧基团。醌氧化还原系统是由醌、半醌和氢醌三类分子组成的可逆氧化还原体系。醌得一电子形成半醌, 半醌得一电子形成氢醌, 半醌分子中存在一个未成对电子, 为半醌自由基。在自然环境下, 这 3种分子一般同时存在于腐殖质中,其中醌和半醌分子组成还原醌形态, 半醌和氢醌分子组成氧化醌形态。在过去对大骨节病地区腐殖质性质的研究中, 由于表征及分析方法落后, 仅通过电子顺磁共振发现半醌自由基的含量在病区与非病区间存在显著差异[1], 通过红外、紫外和荧光等手段均未发现其他结构证据存在显著差异[5–6]。但是,仅仅研究醌氧化还原系统中的一类分子是不够的,应当对整个系统进行研究。平行因子分析法使三维荧光光谱得到进一步的发展, 近年来在腐殖质的研究中广泛应用[7–8]。平行因子分析法通过Matlab程序, 对多个荧光激发发射矩阵(excitation-emission matrix, EEM)的集合进行成分提取, 得到相对独立的荧光成分进行分析,从而获得精确的结构信息。醌氧化还原系统是腐殖质结构中普遍存在的发光基团, 通过对比标准醌类物质的荧光光谱, 可以识别多个氧化醌或还原醌荧光成分[9], 说明荧光平行因子分析法是表征腐殖质醌系统的有效手段。本研究采集大骨节病病区与非病区饮水及沉积物样品, 通过XAD-8树脂法分离其中的胡敏酸和富
里酸, 用三维荧光光谱平行因子分析法对腐殖质中的醌氧化还原系统进行研究, 对比腐殖质不同组分以及醌不同形态与大骨节病的关系。
1 材料与方法1.1 样品采集
采样站点为西藏自治区昌都市大骨节病地区的3个病区与3个非病区, 具体信息见表1和图1。采样区域位于昌都市八宿县境内, 地形为高山峡谷,四周均为雪山, 河水主要源自山顶融雪水。
采样站点中, 6号站点八宿县城为非病区, 其他5个站点位于3个村落, 其中江查村为病区。仲沙村和王排村过去为病区, 经过改水工程后成为非病区。在改水工程前, 仲沙村654人中有240人发病, 在改水工程后仅有1人新发病。王排村在改水工程后无人新发病。从仲沙村和王排村改水工程前、后的饮用水源分别采集样品。
3号站点的水源为岩隙水, 取自冷曲河上游支流。其他站点水源均源自山顶融化的雪水, 其中1, 2和5号站点的水源为冷曲河干流, 6号站点的水源为冷曲河下游较大支流——拉曲河, 4号站点的水源为新辟渠道从山顶引下的雪水, 采样点在村内新建渠道末端。除2号站点外, 水质均清澈。2号站点在仲沙村桥下, 水质发青浑浊, 河岸边有垃圾。
2015年12月, 从每个站点采集表层沉积物2 kg (0~10 cm), 水样 1100~1600 L。水样在当地进行预处理, 首先用 0.5 μm的过滤柱(聚乙烯, 盖雅环保,深圳)过滤, 然后用钠型离子交换树脂(Dowex
50WX8, 西格玛, 美国)去除高价金属离子。最后,将水样用定制的反渗透装置(鹏达源环保, 深圳)浓缩至 13.50~17.00 L。沉积物用自封袋密封, 浓缩水样用塑料瓶保存。样品置于放有冰袋的泡沫箱中冷藏运输。到达实验室后, 浓缩水样于4ºc 冷藏, 沉积物于−20ºc冷冻保存。
1.2 腐殖质提取
使用 XAD-8树脂提纯分离腐殖质组分。为避免树脂中溶解性总有机碳(dissolved organic carbon, DOC)的干扰, 将树脂先用NAOH溶液反复浸提数日, 然后用甲醇索式提取24小时后保存在甲醇中。使用前, 将树脂用超纯水、酸和碱等清洗至 DOC浓度低于 0.1 mg/l[10–11]。
参照Ma等[12]的方法提取浓缩水样中腐殖质。首先, 将浓缩水样用 0.45 μm滤膜(聚醚砜, 津腾,天津)用过滤后酸化至ph=1, 静置过夜。然后, 将溶液用 0.45 μm 滤膜过滤, 再用NAOH溶液洗脱滤膜, 洗脱液为胡敏酸(humic acid, HA)。将滤液用 NAOH溶液调节至ph=2 后, 通过 XAD-8树脂柱吸附, 没有被吸附的流出液为亲水物质(hydrophilic matter, HYI)。用NAOH溶液反向洗脱树脂柱, 洗脱液为富里酸(fulvic acid, FA)。
根据国际腐殖酸协会推荐的方法, 对沉积物中的腐殖质进行提取[13]。首先将沉积物晾干, 研磨过2 mm筛, 然后用HCL溶液提取, 得到FA1。在氮气保护下, 将酸提取后的沉积物用NAOH溶液提取,得到FA2和HA的混合物。将混合物酸化至ph=1,静置过夜, 离心分离HA (沉淀)和FA2 (上清液)。在ph=1的条件下, FA1 和 FA2分别通过XAD-8树脂吸附, NAOH溶液洗脱。将洗脱液合并后, 再次通过树脂吸附洗脱, 得到FA。
为保证组分分离流程的稳定性, 提取实验采用3个平行样。从水和沉积物中共分离出5类组分,分别命名为A-HA (aquatic-ha), A-FA, A-HYI, SHA (sediment-ha)和 S-FA。
1.3 有机质表征
使用总有机碳(total organic carbon, TOC)分析仪(Multi N/C 3100, 耶拿, 德国), 对水和沉积物中各组分的有机碳含量进行测定, 测定方法依据国家标准 HJ 501—2009。
使用荧光光谱仪(F-7000, 日立, 日本)测试所有腐殖质组分, 得到激发发射矩阵图(EEM)。样品测试前调节ph值为 7[14], 以避免ph对荧光的影响,用超纯水稀释至254 nm紫外吸收(UV254)低于 0.10 cm−1, 以消除内滤效应[15]。波长参数: 激发波长为
200~450 nm, 间隔5 nm; 发射波长为 220~550 nm,间隔1 nm。所有样品扣除超纯水空白, 用三角插值法去除瑞丽散射和拉曼散射[16], 荧光强度用超纯水的拉曼峰面积校正[17]。
[18]使用 Stedemon 等 开发的 Domfluor 程序包,在 Matlab2007中进行PARAFAC分析。程序包主要包括以下功能: 识别并去除异常样品; 计算不同因子数模型的残差和; 将EEM集合一分为二单独分析检验有效性等。PARAFAC分析的原理是使用交替最小二乘法来实现三线性模型(荧光强度、激发波长和发射波长)的分解, 使残差平方和达到最小,进而从分解模型中提取独立的荧光成分[19]。
2 结果与讨论2.1 有机质含量
饮水中天然有机质含量与沉积物中可提取腐殖质含量分析结果见图2。饮水中DOC含量为 0.22~ 0.44 mg/l, 远远低于通常天然水体的有机质含量(1~100 mg/l)[20–22], 且天然有机质的3个组分含量大小顺序为 A-HA 沉积物中可提取的腐殖质碳含量在0.003%~ 8.27%之间, 除4号站点外, 其他站点的FA含量均远低于HA。4号站点的可提取腐殖质碳含量远低于其他站点, 仅占 0.003%, 这可能是由于4号站点是新辟渠道, 沉积物腐殖化时间短, 腐殖化程度低,腐殖质较少, 形成速率较慢的HA含量更少。3号站点可提取腐殖质的碳含量为8.27%, 远高于其他站点, 由于其水源类型为岩隙水, 沉积物包含较多的裂隙岩碎粒, 推测其裂隙岩为腐殖化程度极高的泥煤或褐煤, 腐殖质含量较高。其他站点中, 1, 2和5号均位于冷曲河干流, 6号位于冷曲河下游的较大支流拉曲河, 环境条件相似, 因而腐殖质含量比较接近, 在0.03%~0.51%之间。 腐殖质各组分的TOC含量均未在病区与非病区样本间表现显著差异, 表明腐殖质碳含量与大骨节病无显著关系, 应当研究腐殖质的特性在病区与非病区样本间的差异。 2.2 荧光成分的识别 [18]利用 PARAFAC模型 对 90 个EEM的集合(6个站点的5类组分及3个平行样)进行分析, 最终提取出5个荧光成分。各成分的EEM图和激发发射载荷图见图3, 其最大激发波长、发射波长及所对应的物质类型列于表2。从图3可以看出, 成分4有3个峰, 其他成分均有两个峰, 说明荧光成分是多个荧光基团的混合物。这是由于腐殖质结构复杂, 同一腐殖质分子中含有多个荧光基团。 通常可以依据激发波长(Ex)与发射波长(em),将天然有机质的EEM图划分为5个区域[26], 分别对应不同的荧光素, 如图4所示: 区域I和 II为芳香蛋 白, 区域 III为类富里酸, 区域IV为溶解微生物代谢产物, 区域V为类胡敏酸。其中, 区域 III 和V是腐殖化结构的荧光素, 区域I, II和IV是一些未腐殖化结构的荧光素。因此, 本文识别出的荧光成分1, 3和 4均为腐殖化荧光素, 其中成分1和 3包括类富里酸和类胡敏酸荧光素, 成分4主要为类胡敏酸荧光素, 表明成分4反映的HA信息更多。成分 2和 5为未腐殖化荧光素, 成分2主要是溶解微生物代谢产物, 成分5主要是芳香蛋白。 参照文献[9,27–28], 进一步确定荧光成分的物质类型, 结果见表2。两个未腐殖化荧光素中, 成分2为类色氨酸, 成分5为类酪氨酸。3个腐殖化荧光素中, 成分1为类氧化醌荧光素, 成分3为陆地源类腐殖质荧光素, 成分4为类还原醌荧光素, 其在区域IV的较弱吸收可能是类酚荧光素, 这是由于氢醌和半醌分子都含有酚结构[14], 另一方面可能是由于微生物还原使氧化醌转变为还原醌[29], 因而含有少量溶解微生物代谢产物。大部分腐殖化荧光素可以归结到不同形态的类醌荧光素[9], 表明醌氧化还原系统是腐殖化结构中的主要发光基团。Cory等[9]识别出的 13个荧光成分中, 有3个荧光类氧化醌成分和4个荧光类还原醌, 本文识别出的荧光成分中类醌成分的数量及比例与之相似。 2.3 饮水中有机质各荧光成分强度 将腐殖质各荧光成分的强度用DOC标准化处理, 以使分析单位腐殖质中的荧光成分强度, 如图5所示。可以看出, 在水中, 未腐殖化荧光素占主体(成分2和 5), 腐殖化荧光素占比较低(成分 1, 3和 4), 其中成分4占比最低, 说明当地天然有机质中腐殖化结构的占比不高, 且还原醌含量较低。与水中FA相比, HA的腐殖化荧光成分强度较低, 这是由于HA分子量更高, 发光基团过于积聚, 产生 [14] [9]内部淬灭作用所致 。Cory 等 研究的湖泊水体DOM和 FA中类醌成分占荧光总强度的50%左右,高于本研究的FA(约 30%), 这与 2.1节中对本研究地区水体腐殖化进程缓慢的分析结果一致。 考虑到未腐殖化荧光成分的占比较高, 为更清楚地分析腐殖化荧光成分之间的关系, 绘制3个腐殖化荧光成分的百分比柱状图(图6)。可以看出, HA的成分3占比高于FA, 说明HA中非醌荧光素在腐殖化荧光素中的含量高于FA。这是由于HA氧化程度低于 FA[30], 含氧结构相对较少, 因而非醌结构在腐殖化结构中的含量较高。与FA相比, HA的成分1占比较低, 成分4占比稍高, 说明HA中还原醌含量稍有提高, 氧化醌含量相对降低。这也是由于其氧化程度低, 因此醌氧化还原系统的还原程度高, 与成分4反映HA信息更多的结果一致。表 3列出病区和非病区腐殖质中类醌成分的DOC标准化荧光强度, 可以看出, 水中FA的荧光成分 1(p<0.10)和成分 4(p<0.05)以及 HA的成分4 (p<0.10)在大骨节病病区样品中的强度高于非病区样品, 并且表现出显著性差异, 表明在水中腐殖质中, 组成醌氧化还原系统的醌类物质含量与大骨节病存在显著关系。成分4的显著性高于成分1, 说明还原醌形态在病区与非病区样本间的差异大于氧化醌形态。这是由于还原醌比氧化醌的自由基含量更高[29], 因此还原醌能提供更多的半醌自由基, 从而起到更强的致病作用。FA显著性高于HA, 表明FA在病区与非病区之间差异大于HA。在 HA 中,还原醌在醌氧化还原系统中含量较高, 但由于HA溶解度较低, 在水中的DOC含量很低, 因此对大骨节