Effects of Decabrominated Diphenylether-209 on Cell Proliferation and Cell Apoptosis in Human Liver L-02 Cells

ZHU Tingting1, LU Yongfen2, QI Xiujuan1, HUANG Yi1, MENG Haitao3, YIN Donggao1, SUN Taotao1, DENG Chen1,†, WU Desheng4,†

1. State Environmental Protection Key Laboratory of Drinking Water Source Management and Technology, Shenzhen Key Laboratory of Emerging Contaminants Detection and Control in Water Environment, Guangdong Engineering Research Center of Low Energy Sewage Treatment, Shenzhen Academy of Environmental Sciences, Shenzhen 518001; 2. College of Chemistry and Environmental Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060; 3. Zibo Vocational Institute, Zibo 255314; 4. Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen, Institute of Toxicology, Shenzhen Centre for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518055; † Corresponding authors, E-mail: 185390228@qq.com (DENG Chen), dswucn@126.com (WU Desheng)

Abstract The effects of BDE-209 (decabrominated diphenylether-209) on the proliferation and apoptosis of human normal liver L-02 cells were analyzed by CCK-8 and Hoechst 33342/PI methods. The results showed that the inhibition rate of cell proliferation increased with the increase of BDE-209 concentration after 24 hours exposure at different concentration levels (0–70 μg/ml). The IC50 of BDE-209 on human normal L-02 cells for 24 hours was 127.08±24.93 μg/ml, which was analyzed by Spss-probit-logit method. After 24 hours exposure to BDE-209 at different concentration levels (0–15 μg/ml), there was no significant change in cell morphology in each dose group compared with the control group, and only cell reduction was observed in the 15 μg/ml dose group. After apoptotic staining, fluorescence microscopy showed that the number of cells stained with brilliant blue and light powder increased with the increase of BDE-209 concentration, and the apoptosis rate of human normal liver L-02 cells increased with the increase of BDE-209 concentration. Compared with the control group, the difference of each dose group was statistically significant. The results showed that BDE-209 could inhibit the proliferation of human normal liver L-02 cells and increase the apoptotic rate. Key words decabrominated diphenylether-209; human liver L-02 cell; cell proliferation; cell apoptosis

作为溴代阻燃剂, 多溴联苯醚(poly brominated diphenyl ethers, PBDES)广泛应用于塑料制品、电子电气设备、纺织品与生活用品, 已成为全球范围内的持久性环境污染物[1]。PBDES释放到环境介质中持久存在且难降解, 造成环境污染, 并通过食物链进入人体, 危害人体健康。PBDES不仅能影响生物体的生长、神经发育和生殖, 还可在细胞和分子水平导致氧化应激, 促使自由基的产生, 影响相关基因的表达, 甚至引起细胞死亡[2]。

十溴联苯醚(BDE-209)是多溴联苯醚中含溴原子数最多的一种化合物, 由于价格低廉, 性能优越,急性毒性在所有溴联苯醚中最低, 所以在全球使用最广, 如用于电子电器和自动控制设备、建材、纺织品和家具等产品中。据统计, 其使用总量占阻燃剂总量的75%以上。BDE-209 在环境中经光解、高温分解、生物及微生物降解, 极易发生脱溴反应,产生低溴代联苯醚, 其危害性不容忽视[3]。

吴伟等[4]研究了多溴联苯醚胁迫下鲫鱼肝脏微粒体类固醇诱导性同工酶(CYP3A1)和谷胱甘肽转移酶(GST)的响应, 发现鲫鱼暴露于0.10~5.00 mg/l的BDE-47和 5.00~50.0 mg/l的 BDE-209中15天后,肝微粒体中CYP3A1被诱导, 呈显著的剂量–效应

[5]关系。那广水等 将 BDE-47 等 5种溴阻燃剂与人肝 L-02细胞共同培养, 采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)检测5种溴代阻燃剂对人肝L-02细胞的相对增殖率, 并按照 GB/T16886.5—2003/ISO10993 —5: 1999标准, 评价5种溴阻燃剂对人肝L-02细胞的毒性。体外实验表明, 5种溴阻燃剂对人肝L-02细胞均具有抑制作用, 其中 BDE-47, BDE-99 和HBCD呈现剂量依赖关系。因此, 本研究选取BDE209为代表性多溴联苯醚类化合物, 以人肝L-02 细胞系为体外实验系统, 采用 CCK-8 等方法, 评价BDE-209对人正常肝L-02细胞增殖和凋亡的影响,为探讨 BDE-209毒性作用机制提供基础数据和科学依据。

1 材料与方法1.1 细胞与试剂

称取适量的BDE-209粉末溶于DMSO, 用 1640完全培养基(含10%胎牛血清)依次稀释至实验所需浓度, 并使DMSO终浓度低于0.5%, 用 0.22 μm无菌滤膜过滤除菌, 现用现配。

1.2.2

将冻存的人正常肝L-02细胞从液氮罐中取出,迅速放入 40~42ºc 水浴中, 轻轻晃动冻存管, 使细胞迅速解冻, 待冻存液全部溶解后, 在无菌条件下将冻存细胞液转移至15 ml离心管中, 加5 ml 1640完全培养基洗涤细胞, 1000 rpm 离心5分钟, 弃上清液, 加入5 ml 1640完全培养基重悬细胞, 将细胞悬液转移至25 cm2培养瓶中, 在 37ºc 5% CO2条件下进行培养、传代和冻存保种。

1.2.3

使用 0.25% Trypsin-edta 消化肝 L-02 细胞, 1640完全培养基终止消化, 1000 rpm离心5分钟,弃上清液, 加入 1640完全培养基重悬细胞, 以 1× 103个/孔密度接种于96孔板中, 在 37ºc 5% CO2条件下培养24 小时, 待细胞贴壁生长至70%~80%的丰度后, 按照空白对照(1640培养基对照)组、阴性对照(1640 培养基+肝 L-02 细胞)组和不同剂量组(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg/ml), 依次加入BDE209溶液, 每个剂量做6个复孔。在37ºc 5% CO2条件下培养24小时后, 每孔加入10 μl CCK-8, 在37ºc 5% CO2条件下孵育2~3小时, 用酶标仪在450 nm处读取OD值。按以下公式计算: 细胞生长抑制率 =[(阴性对照组 OD −实验组 OD)]/阴性对照组OD×100%。采用 SPSS 19.0 软件 Logit法计算受试物对人正常肝L-02细胞的半抑制浓度IC50。

1.2.4细胞培养细胞活力测定细胞凋亡观察

将对数生长期人正常肝L-02细胞以 1×105 个/孔的密度接种于6孔板中, 在 37ºc 5% CO2条件下培养24 小时, 待细胞贴壁生长至70%~80%的丰度后, 分别加入0, 3.75, 7.5 和 15 μg/ml BDE-209溶液(各组DMSO终浓度为0.5%), 对照组加入1640 培养基和0.5% DMSO, 每个剂量做3个复孔。在37ºc 5% CO2条件下培养24小时, 弃去细胞培养基, 预冷 1×PBS清洗2次, 加入 0.5~1 ml Hoechst 33342染色液, 置于室温避光染色30分钟, 弃染色液, 预冷 1×PBS清洗2 次, 加入 0.5~1 ml PI (终浓度5 μg/ ml)避光染色 15分钟。预冷PBS清洗一遍, 再加

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Table 1

Morphology of cells with Hoechst 33342/PI double staining

介质以及生物体中发现PBDES污染。PBDES亲脂性强, 化学性质稳定, 不易降解, 可以随着食物链生物富集和放大, 还能通过母乳、胎盘和脐带血转移到下一代的体内[6–7]。动物研究表明, PBDES具有一定的致癌和致畸毒性, 其中BDE-209暴露会导致

[8]肝脏和甲状腺肿瘤病变 。还有报道表明, BDE209

[9]能引起雌性或雄性生殖功能的损伤 。周俊等[10]发现, 母鼠怀孕期间暴露于BDE-209 后, 其后代的淋巴细胞分化受到严重影响。

肝脏是PBDES的主要靶器官, BDE-209对于肝细胞的毒性机制尚不明确。细胞增殖抑制率和细胞凋亡率是多数学者采用的一种评定细胞毒性的参数, CCK-8实验方法可以快速、准确地判断环境污染物的细胞毒性, 评价化学污染物的环境危害及人体健康风险。本文细胞增殖结果显示, BDE-209显著抑制肝 L-02细胞的增殖, 对细胞形态影响不明显, 但会造成细胞数量减少。细胞凋亡结果显示, BDE-209可显著地诱导肝L-02细胞的凋亡, 镜下可见明显的荧光信号, 15 μg/ml PBDE-209暴露即可引起显著的细胞凋亡变化。BDE-209对小鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a)具有明显的细胞毒性作用, 通过活性氧的形成对人神经母细胞瘤细胞具有基因毒性, 能显著降低Neuro-2a细胞的活力, 抑制细胞生

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