ACTA Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis
2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株的分离、鉴定及降解特性研究
徐文杰1,2 赵泉林2 罗明汉1 叶正芳2,†
1. 南京工程学院环境工程学院, 南京 211167; 2. 北京大学环境科学与工程学院,北京 100871; † 通信作者, E-mail: zhengfangye@163.com
摘要 针对TNT红水污染土壤生物修复菌种资源匮乏问题, 从复合菌群中分离纯化出一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐(DNTS)降解菌株X2, 经生理生化分析及16S RDNA鉴定, 该菌株属于鞘氨醇单胞菌属。进一步研究环境因素对菌株X2生长的影响, 并探究X2对 2,4-二硝基甲苯-3-磺酸盐(2,4-DNT-3-SO3−)和 2,4-二硝基甲苯-5-磺酸盐(2,4-DNT-5-SO3−)的降解机理及对多种硝基芳香族炸药的降解效果。结果表明, X2的最佳生长条件为30ºc, ph=7和1％盐度。菌株X2对初始浓度为500 mg/kg 的 2,4-DNT-3-SO3−和 2,4-DNT-5-SO3−的降解率分别在第12天和第3天达到100%。液相色谱–质谱(LC-MS)分析表明, DNTS中的硝基被转化为氨基。鞘氨醇单胞菌X2具有广谱降解特性, 不仅可以降解DNTS, 还可以降解2,4,6-三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)和硝基甲苯(MNT)等多种硝基芳香族炸药, 为TNT红水污染土壤生物修复提供可能性。关键词 菌株分离鉴定; 鞘氨醇单胞菌X2; 2,4-二硝基甲苯磺酸盐; 微生物降解
TNT红水是采用亚硫酸钠精制TNT过程中产生的一种废水, 其中的主要污染物为二硝基甲苯磺酸盐(DNTS), 此外还有TNT, DNT和MNT等硝基苯衍生物[1–3]。TNT红水中有机物浓度高且毒性大,处理难度非常大[4–6]。甘肃某地由于TNT红水蒸发池渗漏, 对土壤造成严重污染, 威胁到黄河上游的水质安全。因此, TNT红水污染土壤修复是目前亟待解决的环境问题。
与非生物修复技术相比, 生物修复是一种环境友好且成本更低的方法, 许多微生物可以以有毒有机污染物为底物, 将复杂的有机化合物降解为简单的小分子化合物[7–8]。许多学者分离出TNT高效降解菌株[9–13]。然而, 目前关于 DNTS的生物降解的研究有限。Tsai[14]研究真菌对TNT红水的生物处理方法, 但未涉及降解机理。Zhang等[15]研究固定化微生物技术对TNT红水的生物降解效果, 结果表明只有 2,4-DNT-5-SO3−可被有效降解, 2,4-DNT-3-SO3−不能被生物降解。微生物在自然环境中对DNTS的降解受到诸多环境条件的限制, 普通微生物降解效率有限, 故筛选并分离出高效的降解菌是微生物修复技术的关键基础。本研究组分离出一株能高效降解两种磺酸盐的假单胞菌X5[16], 但能用于2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解的菌种资源仍然匮乏, 未见将鞘氨醇单胞菌属用于磺酸盐降解的研究。
本研究分离纯化能高效降解2, 4-二硝基甲苯磺酸盐的菌株, 通过形态学观察、生理生化性能研究及基因序列分析, 对降解菌进行鉴定, 探讨环境因素对分离出的降解菌株生长的影响, 研究分离出的菌株对磺酸盐的降解机理以及对其他硝基芳香族化合物的降解效果。
1 材料与方法1.1 实验材料
2,4-DNT-3-SO3−和 2,4-DNT-5-SO3−由兰州大学合成。污染土壤取自甘肃某TNT红水污染场地, 未污染土壤取自当地远离工厂的洁净土壤。磺酸盐降解菌分离自投加复合微生物的DNTS污染土壤。
LB培养基: 胰蛋白胨10 g、Nacl 10 g和酵母提取物5 g溶于 1000 ml蒸馏水中, 用 1 mol/l 的NAOH调节ph值至 7.2±0.2, 用高压灭菌锅在121ºc条件下灭菌15分钟。在上述培养基中加入18%琼脂, 得到本研究所用的固体培养基。
无机盐培养基(MSM): Nacl 30 g, NH4NO3 3 g,
KH2PO4 1g, K2HPO4 1g, Cacl2 0.02g, MGSO4 0.5 g,去离子水1 L; 微量元素溶液(NICL2·6H2O 0.03 g, FESO4·7H2O 0.2 g, CUSO4·5H2O 0.03g, COCL2·6H2O 0.1 g, MNSO4 0.1 g, NA2MOO4·2H2O 0.04 g, H3BO3 0.03 g和去离子水1 L) 10 ml。用高压灭菌锅在121ºc条件下灭菌15分钟。
1.2 菌株分离与鉴定
取2g投加复合微生物的DNTS污染土壤, 放入装有 100 ml无菌 LB液体培养基的锥形瓶中, 在30ºc 和 120 rpm的恒温摇床上进行震荡, 富集培养24小时。取l ml培养液, 采用稀释涂布平板法分离纯化菌株。
挑取单克隆菌株在LB液体培养基中活化培养一定的时间, 采用场发射扫描电子显微镜对菌株形
[17]态进行观察。根据《常见细菌系统鉴定手册》研究其生理和生化特性, 包括革兰氏染色、甲基红测试、七叶灵水解、明胶水解、硝酸盐还原、吲哚生成、H2S生成、V-P测试以及不同碳源利用。
通过16S RDNA序列分析鉴定分离的菌株。用细菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio, D1600)提取分离菌株的基因组DNA。所用引物为8F (5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1513R (5'-TACGGT TACCTTGTTACGACTT-3'), 通过聚合酶链反应(PCR)扩增提取DNA。纯化的DNA送至上海铂天生物技术有限公司进行测序。使用BLAST进行核苷酸序列相似性分析。
1.3 环境因素对菌株生长的影响
挑取菌株的单菌落并转移到无菌LB液体培养基中, 并在30ºc和 120 rpm条件下培养12小时作为种子培养物。
1) 温度的影响: 以1%的接种量, 将菌株的种子培养液接种于LB液体培养基中, 分别将锥形瓶置于20, 25, 30, 35和 40ºc 的摇床中, 120 rpm培养24小时, 测定菌液的OD600值。每组设置3个重复。
2) ph的影响: 以1%的接种量, 将菌株的种子培养液接种于ph分别为5, 6, 7, 9和11的LB液体培养基中, 30ºc和120 rpm培养24小时, 测定OD600值。培养基的ph值用 1N HCL 和 1N NAOH调节。每组设置3个重复。
3) 盐度的影响: 以1%的接种量, 接种菌株于Nacl浓度为0, 1%, 3%, 5%, 7%和10%的无Nacl LB液体培养基中, 于 30ºc和 120 rpm培养24小时, 测定 OD600值。每组设置3个重复。
1.4 菌株对磺酸盐及其他硝基化合物的降解能力
将菌株接种在灭菌的LB液体培养基中活化24小时。将各菌液的OD600稀释至1, 取10 ml菌液分别加入含100 g浓度为500 mg/kg的 2,4-DNT-3-SO3−和2,4-DNT-5-SO3−污染土壤的锥形瓶中, 并补加30 ml水, 调节液土比为2:5。将锥形瓶置于30ºc的恒温培养箱中培养。每隔一定时间取样, 测定土壤中二硝基甲苯磺酸盐浓度。每组设3个重复。为研究菌株对不同硝基芳香化合物的降解能力, 分别配置浓度为100 mg/kg的TNT, 2,4-DNT,2,6DNT, 2-MNT, 3-MNT 和 4-MNT 污染土壤。分别取 12.5 ml菌株的种子培养物, 6000rpm离心 5分钟收集菌体, 并重新悬浮于 40 ml MSM培养基中。将菌悬液加入含100 g各污染物土壤的锥形瓶中,于 30ºc培养。每组设3个平行样。7天后, 取样测定各硝基化合物浓度。
1.5 2,4-二硝基甲苯磺酸盐及其降解产物、硝基化合物的测定
两种2,4-二硝基甲苯磺酸盐的测定: 取2 g土样和 10 ml超纯水加入15 ml离心管中, 涡旋振荡30秒, 30ºc超声波振荡3小时, 10000 rpm离心5分钟,取上清液用0.45 μm水系滤膜过滤, 用高效液相色谱(HPLC)进一步测定其含量。测定条件如下: SBAQ色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱温为40ºc, 检测波长为230 nm。以乙腈:磷酸二氢钾溶液(0.68‰)为流动相进行梯度洗脱, 流速为1.0 ml/min, 进样量为20 μl。采用液相色谱质谱联用仪对降解过程中的产物进行分析。色谱条件: 色谱柱采用 Agilent Extendc18 column (150 mm×2.1 mm, 5 m), 柱温为 40ºc,进样量为10 L, 检测波长为230 nm; 流动相为乙
酸铵和乙腈梯度洗脱, 流速为0.3 ml/min。质谱条件: ESI 的电离雾源, 二级质谱负离子扫描模式, 离子阱SL系统; 采用MRM的 isolation 模式, 目标离子为 m/z 261; 扫描范围为m/z 50~400, 最长积累时间为300 ms, 毛细管电压为3500 V, 气化压力为35 psi (2.4×105 Pa), 干燥器(N2)流速为8.0 ml/min, 温度为330ºc, 破碎电压为1.0 ev。
TNT等硝基化合物的测定: 取2g土样和10 ml乙腈加入15 ml离心管中, 涡旋振荡30秒, 4ºc超声波振荡3小时, 10000 rpm离心5分钟。取上清液用0.45 μm有机系滤膜过滤, 用HPLC进一步测定硝基芳香族化合物含量。测试方法如下: SB-AQ色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱温为30ºc, 检测波长为246 nm。流动相为甲醇和超纯水(1:1), 流速为 1.0 ml/min, 进样量为20 μl。
2 结果与分析2.1 降解菌株的鉴定
将本研究分离出的磺酸盐高效降解菌株编号为X2, 其在LB固体培养基上的群落形态及电镜照片如图1所示。菌株X2在LB平板培养基上生长的菌落形态特征为黄色, 单个菌落呈圆形, 边缘整齐,表面光滑有光泽。在电子显微镜下, X2菌体为杆状, 长度约为2~3 μm。
菌株的生理生化试验结果如表1所示, X2为革兰氏阴性, 可耐受温度范围为 4~41ºc, V-P试验、亚硝酸还原和产酸试验结果为阳性, 明胶水解和H2S产生试验结果为阴性, 能够代谢利用多种碳源,如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、L-鼠李糖和纤维二糖等。
将菌株X2 的 16S RDNA序列在 Genbank 数据库中进行 BLAST 比对, 与鞘氨醇菌 Sphingobium yanoikuyae NBRC 15102的相似度为100％。
2.2 环境因素对菌株生长的影响
通过测定培养24小时后的OD600 值, 研究不同环境因素对菌株X2生长的影响。图2(a)显示温度对 X2生长的影响, X2在 25~40ºc的温度范围内均具有较好的生长效果, OD600在 20~30ºc范围内随温度升高而增加, 在 30ºc时生长效果最佳, 超过30ºc
[18]后 OD600值减小。类似地, Park 等 采用 Sphingobium chungbukense KCTC 2955降解邻苯二甲酸酯的研究中, 降解率在20~30ºc范围内随温度的升高而升高, 温度超过30ºc 后, 降解效率和生长速率均显著下降。图2(b)显示 ph对细菌生长的影响, X2可在 7~9 的 ph范围内快速生长, 最佳 ph值为7。菌株X2对酸性及碱性环境具有一定的抵抗力, 但在 ph 为 3 和 11时生长受到显著的抑制。同样地,
[19] Fu等 指出鞘氨醇单胞菌FB3可在 ph5~9范围内降解 PAH, 在 ph=7时降解效果最佳, 可能是因为ph过低或过高会改变生物大分子(如蛋白质和核酸)的电荷, 影响其生物活性, 同时可能改变细胞膜的电荷, 从而阻碍细胞膜吸收营养物质[20]。图 2(c)显示盐度对细菌生长的影响, 菌株X2在 Nacl浓度为0~3%之间均具有较好的生长效果, 在 Nacl浓度为1%时生长最佳, 超过5%时生长受到显著抑制。类
[21]似地, 李朔 发现, 鞘氨醇单胞菌 YL-JL2C 在 0~ 2%盐度范围内可生长, 在Nacl 浓度为 1.5%条件下
[22]生长最优。边晨凯 发现, 在 Nacl浓度为1%时,鞘氨醇单胞菌B1对咔唑(CA)的降解率在96小时后达到 90%, 但当 Nacl浓度达到2%后, 降解率只有50%; 而 Nacl浓度≥3%时, 菌株B1对CA基本上不降解。由此说明, 菌株B1具有一定的耐盐能力, 能在较低盐度条件下高效地降解CA。
2.3 菌株对2,4-二硝基甲苯磺酸盐的降解机理
在菌株 X2最佳生长条件(30ºc, ph=7, 盐度1%)下进行生物降解试验。菌株X2对两种2,4-二硝基甲苯磺酸盐的降解曲线如图3所示。可以看出,当 2,4-DNT-3-SO3− 和 2,4-DNT-5-SO3− 浓度为 500 mg/kg 时, 菌株X2能够完全降解两种磺酸盐, 所需时间分别为 12 天和 3 天。2,4-DNT-5-SO3−比 2,4DNT-3-SO3−更易被生物降解,可能是由于 2,4-DNT3-SO3−的空间位阻大, 导致其难以被还原[23]。Zhang
[15]等 研究复合菌群B925 对 TNT红水的降解效果,结果表明系统在稳定期对2,4-DNT-5-SO3−具有较高的降解率, 而2,4-DNT-3-SO3−不能被降解。本研究分离出的鞘氨醇单胞菌X2对两种磺酸盐均具有较好的降解效果。
图 4为磺酸盐在菌株X2降解前后的液相色谱图。在降解前, 色谱图中两个峰P1和P2 (质谱分析表明两峰对应的质荷比均为 261)分别对应 2,4DNT-3-SO3−和 2,4-DNT-5-SO3−。经 X2 降解后, P1和P2峰消失, 说明 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5
SO3−已被完全降解, 同时出现3个新峰(P3~P5)。通过LC-MS进一步研究生物降解产物, P3, P4和P5 的主要碎片离子质荷比分别为217, 217 和 231, 推测其对应的物质分别为2-羟基氨基-4-氨基甲苯-5SO3−、2-羟基氨基-4-氨基甲苯-3-SO3−和4-氨基 -2MNT-3-SO3−。由此推断,在X2降解代谢两种2, 4二硝基甲苯磺酸盐的过程中, 苯环上的两个硝基还原为羟胺基, 并进一步还原为氨基。Lin 等[24]报道TNT的好氧降解过程为一个硝基还原形成羟胺基,并进一步还原成氨基。与TNT类似, DNTS的电子密度极小, 因此不可能进行氧化攻击, 在有氧和无氧条件下都经过还原途径降解[25]。与母体相比, 还原产物的电子密度降低, 更易于被氧化, 在好氧条件下可被进一步氧化成小分子物质。
2.4 菌株对其他硝基芳香族炸药的降解
菌株X2对硝基化合物的降解效果如表2所示。经过7天的降解, TNT, 2,4-DNT, 2,6-DNT, 2-MNT, 3
MNT和 4-MNT的浓度分别从 99.65±2.39, 100.27± 2.62, 99.96±2.24, 98.84±2.58, 101.11±2.51 和 99.47± 1.84 mg/kg 下降至 10.93±1.82, 35.21±2.17, 56.08± 2.45, 71.44±2.98, 62.04±2.92 和 64.80±1.86 mg/kg,去除率分别为 89.03%, 64.88%, 43.90%, 27.72%, 38.64%和34.85%。以上结果表明, 菌株X2对硝基化合物具有广谱降解特性, 不仅可以降解 DNTS,还可以降解 TNT, DNT 和 MNT等硝基芳烃污染物。目前, 已有研究者分离出TNT, DNT和 MNT降解菌株, 如 Lee等[26]发现 Pseudomonas sp. HK-6含有编码硝基还原酶的pnrb 基因, 能利用TNT作为氮源还原TNT。然而, 这些研究中分离出的菌株往往只对某一种火炸药污染物具有较好的降解性,而实际火炸药污染场地同时含有多种硝基芳香族化合物。本研究中分离的高效降解菌株对多种硝基化合物都具有较好的降解能力, 更适用于火炸药污染场地的修复。
3 结论
本研究从复合菌群中分离出一株DNTS降解菌株 X2, 经过生理生化分析及16S RDNA鉴定, 确定该菌株为鞘氨醇单胞菌属。X2的最佳生长条件为30ºc, ph=7.0 和 1 ％盐度。该菌株对 2,4-DNT-3SO3−和2,4-DNT-5-SO3−降解率分别在第 12天和第3天达到100％。X2通过还原路径降解DNTS, 其降解路径为两个硝基被逐步还原为羟胺基, 并进一步还原为氨基。同时, 菌株X2具有广谱降解特性, 不仅可以降解DNTS, 还可以有效地降解其他硝基芳香族火炸药污染物(如TNT, DNT和MNT)。TNT红水污染土壤的成分复杂, 处理难度大, 鞘氨醇单胞菌 X2的广谱降解特性可以极大地扩展其在环境中的应用, 为修复受各种硝基芳香族化合物污染的场地提供一种环保且廉价的方法。
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