不同电针刺激强度对糖尿病胃轻瘫大鼠胃肠运动及饥饿素的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Tcm -

吴雪芬,刘丽,郑雪娜,郭鑫,谢志强,谢莉娜,袁建菱,岳增辉

湖南中医药大学针灸推拿学院,湖南 长沙 410007

摘要:目的 观察不同电针刺激强度对糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠胃肠运动和饥饿素的影响,探讨不同电针刺激强度治疗DGP的效应差异。方法 60 只 SD大鼠随机分为空白组、模型组和小、中、大刺激量组,每组 12只。采用单次腹腔注射2%链脲佐菌素配合高脂高糖饮食建立DGP大鼠模型。造模成功后,分别采用电针小、中、大刺激量进行干预,连续15 d。用血糖仪和血糖试纸每周测定血糖;治疗结束后以酚红为标记物,观察大鼠胃排空率及小肠推进率;ELISA 检测血清饥饿素含量,RT-PCR 检测下丘脑饥饿素的 mRNA 表达,免疫组化检测下丘脑饥饿素的蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠胃排空率及小肠推进率显著降低,血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素 mRNA表达显著降低,下丘脑饥饿素蛋白表达显著升高;与模型组比较,各针刺组大鼠胃排空率、小肠推进率、血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素 mRNA表达显著升高,下丘脑饥饿素蛋白表达明显降低,且大刺激量组优于中、小刺激量组。结论 电针可通过上调饥饿素含量有效促进DGP 大鼠胃肠运动,改善胃排空迟缓症状,且大刺激量组疗效更佳。关键词:糖尿病胃轻瘫;电针;刺激强度;饥饿素;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.009

中图分类号:R245 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0036-05

Effects of Different Electroacupuncture Intensity on Gastrointestinal Motility and Ghrelin of Diabetic Gastroparesis Rats

WU Xue-fen, LIU Li, ZHENG Xue-na, GUO Xin, XIE Zhi-qiang, XIE Li-na, YUAN Jian-ling, YUE Zeng-hui

Acupuncture and Massage College, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China Abstract: Objective To observe the effects of different electroacupuncture (EA) intensity on gastrointestinal motility and expression of Ghrelin in hypothalamus in diabetic gastroparesis (DGP) rats; To explore the effedt differences of different EA intensity. Methods Sixty rats were randomly divided into normal control group, model group, weak EA stimulation group, middle EA stimulation group, and strong EA stimulation group, with 12 rats in each group. The DGP model was established by intraperitoneal injection of 2% streptozotocin and raised by high-sugar and high-fat fodder. After modeling, each EA stimulation group was intervened by EA with different intensity, for 15 d. Blood glucose was measured weekly with blood glucose meter and blood glucose test strips. After the treatment, phenol red was taken as a marker to observe the gastric emptying rate and small intestine propulsion rate. Serum Ghrelin levels were detected by ELISA, and mRNA expression of Ghrelin in the hypothalamus was detected by RT-PCR. Immunohistochemical detection was used to detect hypothalamic Ghrelin protein expression. Results Compared with the normal control group, gastric emptying rate and small intestine propulsion rate of the model group decreased; the content of Ghrelin in the serum. and expression of Ghrelin mRNA of hypothalamus also decreased significantly; gray value of Ghrelin of hypothalamus increased significantly. Compared with the model group, the gastric emptying rate, small intestine propulsion rate, content of

基金项目:国家重点基础研究发展计划(2014CB543102);国家自然科学基金(81673886)

通讯作者:袁建菱,E-mail:jly888666@qq.com;岳增辉,E-mail:624755064@qq.com

Ghrelin in the serum, and the expression of Ghrelin mRNA of hypothalamus significantly increased in the three EA stimulationgroups, and the gray value of the hypothalamic Ghrelin significantly decreased. The effect of strong EA stimulation group was better than weak EA stimulation group and middle EA stimulation group. Conclusion EA can effectively promote bowel movement, and improve the symptoms of delayed gastric emptying of DGP rats by increasing Ghrelin content. The curative effect of strong EA stimulation group is better.

Keywords: diabetic gastroparesis; electroacupuncture; stimulation intensity; Ghrelin; rats

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis,DGP)是糖尿病的常见慢性并发症之一。饥饿素可促进摄食、

保护胃黏膜、加快胃排空[1-2]。研究表明,DGP 胃运动障碍与中枢及外周饥饿素基因表达减少密切相关,DGP大鼠胃组织饥饿素含量及饥饿素mRNA 表

达均显著下降[3-5]。有研究显示,电针可有效改善 DGP

患者胃排空迟缓症状[6-8]。不同刺激强度是影响电针疗效的重要参数,一般而言,电针刺激强度分为小、中、大刺激 3 种。本实验建立 DGP 大鼠模型,观察电针不同强度对 DGP 大鼠血糖、胃排空、小肠推进率及下丘脑饥饿素 mRNA 和蛋白表达的影响,明确电针对 DGP大鼠饥饿素含量的调节机制,探讨电针改善大鼠胃排空、增强胃动力是否与该机制相关,以及其疗效与电针强度的关系,为临床治疗 DGP 提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF 级 SD 大鼠 60 只,8~9 周龄,雌雄各半,体质量 200~220 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号 43004700019099。饲养于湖南中医药大学实验动物中心,温度 22~25 ℃,相对湿度

40%~60%。适应性喂养 1 周后,将大鼠随机分为空白组、模型组和小、中、大刺激量组,每组12 只。

1.2 主要试剂与仪器水合氯醛,天津科密欧化学试剂公司;链脲佐菌素(STZ),美国 Sigma 公司,批号 015H1492;酚红,天津恒兴化学试剂公司;反转录试剂盒,北京康为世纪生物科技有限公司;Trizol,美国 Invitrogen 公司;柠檬酸钠、柠檬酸,湖南汇虹试剂公司;饥饿素抗体,英国 Abcam 公司。华佗牌 0.30 mm×25 mm针灸针,苏州医疗用品厂有限公司;稳豪倍易型血糖仪及试纸,美国强生公司;华佗牌 SDZ-Ⅴ型电针仪,苏州

医疗用品厂有限公司;TGL-18R台式冷冻离心机,德国汉堡公司;PIKO REAL 96 荧光定量PCR 仪,美国Thermo 公司;免疫组化试剂盒,德国罗氏公司;免

疫图文分析系统,北航公司,MIAS-1000 型;自动显微镜照相系统(日本OLYMPUS 公司)。

1.3造模

造模大鼠禁食12 h,临用前将 STZ 用 0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2,4 ℃)以2%浓度配制,造模大鼠按 55 mmol/kg 剂量经左下腹腔内一

次性注射[9]。空白组大鼠于腹腔内一次性注射等体积

0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后72 h 取尾静脉血,用血糖仪和血糖试纸测大鼠非空腹血糖,

即刻血糖≥16.7 mmol/L 者作为糖尿病大鼠。空白组大鼠予普通饲料规律喂养,模型组和小、中、大刺激量组大鼠予高脂高糖饲料(普通饲料∶熟猪油∶蔗

糖∶奶粉∶鸡蛋=58∶15∶20∶5∶2)单日上午、双

日下午不规律喂养[10],连续 8周。实验期间检测随机

血糖,凡血糖<16.7 mmol/L 及死亡大鼠剔除实验。

血糖≥16.7 mmol/L 及一般情况、大便性状与空白组比较差异明显认为DGP 模型成功[11]。

1.4 干预

穴位定位参照《实验针灸学》[12]“动物针灸穴位图谱”和拟人对照法进行选取。“足三里”(后三里)位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处。“梁门”位于胸剑联合到肚脐连线中点旁开至锁骨中线中点处。“三阴交”位于后肢内踝尖直上10 mm。电针各组于造模第8周末开始针刺治疗。空白组和模型组将大鼠捆绑于鼠板上,不行电针,每次20 min,1 次/d,连续 15 d。

小刺激量组:取同侧“足三里”“梁门”“三阴交”,针刺穴位得气后施用平补平泻、中等幅度、均匀的提插捻转手法,行针1 min后接电针,波形为疏密波、频率为 20/100 Hz,电针强度参数为 1(0.12 mA),动物双下肢轻微颤动,电针时间20 min,两侧穴位交替

使用,1次/d,治疗后正常进食,连续15 d。中刺激量组:电针操作同小刺激量组,频率为

20/100 Hz,电针强度参数为 2(0.24 mA),动物双下肢持续抖动,电针时间20 min,两侧穴位交替使用,

1次/d,治疗后正常进食,连续15 d。大刺激量组:电针操作同小刺激量组,频率为

20/100 Hz,电针强度参数为 3(0.36 mA),动物双下肢持续较大幅度抖动,电针时间20 min,两侧穴位交

替使用,1次/d,治疗后正常进食,连续15 d。

1.5 血糖测定每周尾静脉采血,血糖仪和血糖试纸测定血糖。

1.6 胃排空率测定

治疗结束后第2日大鼠给予2 mL酚红溶液灌胃,

20 min后处死,取大鼠全胃。测定方法参照文献[9],

计算大鼠胃排空率。胃排空率(%)=(1-实测酚红 OD值÷标准酚红OD 值)×100%。

1.7 小肠推进率测定将取出的小肠铺于白纸上,测量幽门至回盲部全长及幽门至酚红所到距离,取两者比值即为小肠推进

率(酚红在小肠中移行距离÷小肠全长×100%)。

1.8 血清饥饿素含量测定大鼠麻醉腹主动脉采血,血液标本置于非抗凝管中,常温静置20 min,4 ℃、3000 r/min 离心 10 min,

收集上清液,将上清液冷冻置于-20 ℃或-80 ℃冰箱保存。ELISA检测饥饿素,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.9 下丘脑饥饿素mRNA表达测定采用实时荧光定量PCR测定。大鼠处死后断头,取大鼠下丘脑。取脑组织约0.02 g,加入 1 mL Trizol研磨匀浆,加三氯甲烷震荡,离心,加等体积异丙醇静置。低温离心后弃上清保留沉淀,加乙醇震荡。低温离心,弃上清液,加无菌无酶水溶解沉淀。吸取2 μL RNA 溶液运用紫外分光光度计于波长 260、280 nm处测定吸光度,计算其浓度、纯度。用相对定量 2-ΔΔCt法分析结果,ΔCt=各样本目的基因 Ct 值-各样本β-actin 的 Ct 值,ΔΔCt=ΔCt-空白组 Ct 值。

1.10 下丘脑饥饿素蛋白表达测定采用免疫组化测定。取大鼠0.25 g下丘脑组织, PBS 冲洗,4%多聚甲醛固定,常规脱水、包埋、切片,经脱蜡、抗原修复、过氧化氢灭活、血清封闭,

添加饥饿素抗体,4 ℃过夜,滴加生物素标记的二抗及辣根过氧化酶各50 μL,室温孵育 15 min,苏木素衬染细胞核,冲洗、封片,显微镜观察。胞膜上或胞质内出现棕黄色片状或颗粒状物为阳性反应。高倍镜

下(400×)每张切片随机取3个视野,用 OLYMPUS医学图文分析系统分析,取其平均值作为该切片指标表达的平均灰度值。

1.11 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示。组间比较采用方差分析,方差齐多重比较

用 LSD法,方差不齐用 Tamhane’s T2 检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般状况实验期间,空白组大鼠日常活动正常,毛发光泽良好,精神良好,饮食饮水正常,大小便无显著改变。造模大鼠在造模后 3 d,出现多饮多食多尿等糖尿病症状;第4周开始,出现活动、反应迟缓及精神状态欠佳等症状;第6周开始,出现形体消瘦,腹部膨隆,皮毛泛黄疏松无光泽,大便性状改变、气味难闻,部分大鼠出现感染病灶,合并眼病、四肢红肿等。

2.2 电针对模型大鼠血糖、胃排空率、小肠推进率的影响

与空白组比较,模型组大鼠血糖显著升高,胃排

空率及小肠推进率显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,各针刺组血糖有下降趋势,但差异无统

计学意义(P>0.05);各针刺组小肠推进率及胃排空

率显著上升(P<0.05)。结果见表 1。

2.3 电针对模型大鼠血清饥饿素含量及下丘脑饥饿素 mRNA和蛋白表达的影响

与空白组比较,模型组血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素 mRNA 表达显著降低(P<0.01),下丘脑饥

饿素蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,小、中、大刺激量组血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素mRNA表达明显升高,下丘脑饥饿素蛋白表达显著降

低(P<0.05);与小、中刺激量组比较,大刺激量组血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素 mRNA 表达显著升

高,下丘脑饥饿素蛋白表达显著降低(P<0.05)。结果见表2、图 1。

3 讨论

临床上 DGP 以早饱、上腹胀满、嗳气、恶心、呕吐等为主要表现。针刺刺激量可直接影响针灸临床疗效,电针的运用能规范针刺刺激量,针刺电流强度是电针参数之一,是影响针效和改变针效机制的重要

因素,不同电流强度治疗效果差异明显[13-14]。DGP病位在胃,且与脾密切相关,针刺治疗选取足阳明胃

经、足太阴脾经穴位居多[15-17]。足三里为足阳明胃经之合穴,针刺“足三里”对胃肠道的生理活动具有双向调节的作用,胃弛缓时可以使其收缩增强,胃进展时可以变为弛缓,从而达到治疗胃肠道疾病的目

的[18]。三阴交为足太阴脾经腧穴,针刺“三阴交”可

改善大鼠胃局部组织微循环并能保护胃黏膜[19]。梁门为足阳明胃经腧穴,针刺“梁门”对大鼠胃黏膜细胞

HSP70 mRNA 的表达有促进作用[20]。饥饿素是生长激素释放激素(GHSR)的天然配体,GHSR也广泛存在于中枢与外周。在外周,胃组织饥饿素可与相应的受体结合,从而增加平滑肌收缩幅度,进一步加强胃肠动力、调节消化系统功能。在中枢,饥饿素与其功能性受体 GHSR-1α 结合,刺激迷走神经通路及胆碱能通路产生神经冲动,促进胃酸分泌及胃肠蠕动,从而增加胃排空。饥饿素是GHSR的内源性配体,其生物活性较强,能调节生长激素分泌、加快胃运动、保护胃黏膜等。饥饿素产生于胃黏膜的内分泌细胞,能促进小肠蠕动和胃排空。研究显示,大鼠腹腔注射饥饿素可显著促进胃排空,同时增

强胃窦幽门协调运动[21]。饥饿素作为一种脑肠肽,生理状态下,胰岛素、血糖的高低可影响饥饿素的分泌;病理状态下,饥饿素分泌出现紊乱。在糖尿病早期阶段,糖尿病的多食和胃肠蠕动加速,会使胃分泌的饥饿素明显增多;在糖尿病后期阶段,血浆饥饿素水平降低,这与胃肠蠕动减慢甚至胃轻瘫有关。有研究表明,伴有 DGP 的糖尿病患者血浆饥饿素水平比单纯

糖尿病患者明显降低[22-23]。本实验结果显示,大鼠血糖、下丘脑饥饿素蛋白表达均高于空白组,胃排空率、小肠推进率及血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素 mRNA表达均低于空白组, 表明 DGP 模型制作成功。针刺干预后,模型大鼠胃排空率、小肠推进率降低及血清饥饿素含量、下丘脑饥饿素 mRNA 表达升高,下丘脑饥饿素蛋白表达降低,并能一定程度降低DGP大鼠血糖,从而改善DGP大鼠胃运动缓慢症状,这与相关研究一致。如彭艳

等[24]采用电针干预 DGP大鼠,探讨电针改善DGP 大鼠胃运动的机制,结果表明,电针治疗可降低 DGP大鼠血糖,促进胃排空,促进胃窦组织饥饿素蛋白表

达,从而改善大鼠胃运动。林亚平等[25]通过比较不同电针频率刺激胃扩张疼痛大鼠“足三里”,发现低、高频电针均能明显降低胃扩张疼痛行为学评分,且高频电针组优于低频电针组,可使下丘脑组织P物质、内啡肽阳性细胞数持续增加。本实验结果显示,大刺激量组较小、中刺激量组疗效好,提示电针大刺激量组能更有效治疗DGP,缓解 DGP临床不适症状。本实验为动物实验研究,在临床应用中,应根据不同疾病、患者体质、耐受性、轻重程度等综合考虑,以选取更适宜的电针强度进行治疗。本实验通过比较电针小、中、大刺激量针刺“足三里”等穴对 DGP 模型大鼠胃排空的调节作用,表明电针可通过上调饥饿素含量有效改善 DGP 模型大鼠胃排空迟缓症状,且电针大刺激量疗效更佳,为 DGP 的临床治疗方案提供一定的依据。

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(收稿日期:2017-08-16)

(修回日期:2017-08-31;编辑:华强)

空白组模型组小刺激量组中刺激量组图 1 各组大鼠下丘脑饥饿素阳性表达(免疫组化染色,×400)大刺激量组

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