电针对糖尿病周围神经病变大鼠脊髓脂氧合酶的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Tcm -

王志福1,杨意州1,刘建波1,李长征1,龚德贵2,俞向梅 1

1.福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122;

2.福建中医药大学附属康复医院,福建 福州 350003

摘要:目的 观察电针对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠脊髓脂氧合酶(LOX)的影响,探讨其干预DPN的作用机制。方法 30只实验大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、脂氧素组、黄芩素组,每组6只,模型组大鼠采用单次腹腔注射链脲佐菌素造模,尾静脉采血检测血糖,筛选DPN动物模型,不干预。电针组大鼠选取“肾俞”“足三里”电针2周;脂氧素组大鼠脊髓鞘内注射脂氧素3次;黄芩素组大鼠脊髓鞘内注射黄芩素 3 次。电子佛莱毛检测大鼠机械痛行为学,RT-PCR 检测大鼠 LOX 基因水平,ELISA 检测大鼠坐骨神经髓鞘碱性蛋白(MBP)表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠机械痛阈值及坐骨神经MBP含量显著降低

(P<0.01),大鼠脊髓 5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,电针组、脂氧素组和黄芩素组大鼠机械痛阈值和坐骨神经MBP含量显著升高,脂氧素组大鼠脊髓 5-LOX mRNA 表达

显著降低(P<0.01),电针组和黄芩素组大鼠脊髓 5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA 表达显著降低(P<0.01)。结论 电针能减轻DPN大鼠痛敏反应,修复坐骨神经损伤,其机制可能与抑制脊髓LOX活性有关。关键词:糖尿病周围神经病变;电针;脊髓;脂氧合酶;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.013

中图分类号:R245 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0056-05

Effects of Electroacupuncture Therapy on Expression of Spinal Lipoxygenase in Rats of Diabetic Peripheral Neuropathy

WANG Zhi-fu1, YANG Yi-zhou1, LIU Jian-bo1, LI Chang-zheng1, GONG De-gui2, YU Xiang-mei1

1. Integrative Medicine College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;

2. University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital, Fuzhou 350003, China Abstract: Objective To observe the effects of electroacupuncture therapy on the expression of spinal lipoxygenase (LOX) in rats of diabetic peripheral neuropathy (DPN); To discuss its mechanism in intervening DPN. Methods Thirty experimental rats were randomly divided into five groups: normal, DPN, electroacupuncture, LXA4 and Baicalein, 6 rats in each group. The model group was injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ), and the animal model of DPN was screened by blood sampling of tail vein with blood glucose, without intervention. Electroacupuncture was applied to bilateral “Shenshu” and “Zusanli” acupoints in electroacupuncture group for two weeks. The LXA4 and Baicalein groups were successfully intrathecal injected 3 times with LXA4 and Baicalein in the DPN rats. The paw withdrawal threshold was measured with electronic Frye fibers. The mRNA levels of LOX in the

L4~5 spinal cord of DPN rats were detected with real-time PCR analysis. The protein concentration of sciatic nerve MBP was detected with ELISA analysis. Results Compared with the normal group, the mechanical pain threshold and sciatic nerve MBP content in the model group significantly decreased (P<0.01), and the levels of 5-LOX, 12-LOX and

15-LOX mRNA in the spinal cord of the model group significantly increased (P<0.01). Compared with model group, the mechanical pain threshold and MBP content of sciatic nerve in electroacupuncture group, LXA4 group and Baicalein group significantly increased, and the 5-LOX mRNA level in spinal cord of LXA4 group significantly

基金项目:国家自然科学基金(81774385、81704149);福建省自然科学基金(2016J01391);福建省教育厅中青年教师科研

项目(JA15250);福建省高校杰出青年科研人才项目(2015年);福建省卫计委青年科研课题项目(2015-1-79);福建省自然科学

基金青年创新项目(2015J05163)

通讯作者:俞向梅,E-mail:yxmtcm@163.com

decreased (P<0.01). The expressions of 5-LOX, 12-LOX and 15-LOX mRNA in electroacupuncture group and Baicalein group significantly decreased (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture therapy may reduce the pain response and restore the impairment of sciatic nerve in DPN rats through inhibiting the gene expression of LOXs in spinal cord.

Keywords: diabetic peripheral neuropathy; electroacupuncture; spinal cord; lipoxygenase; rats

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病常见并发症之一,在糖尿病患者中发病率约20%。临床表现为肢体远端明显疼痛、麻木,严重者可致残;DPN实验大鼠表现为热痛觉过敏、机械痛觉超敏或者触觉迟钝等感觉异常情况。DPN与其他神经病理性疼痛发病基础不同,治疗棘手,甚至出现对各类西药的抵抗,长期应用西药治疗有一定的不良反应。针刺疗法基于中医辨证论治原则,治疗DPN安全有效,临床研究表明,电针对急慢性痛均有镇痛、

促进周围神经损伤修复作用[1]。

研究表明,脂氧合酶(LOX)作为脂氧素(LXA4,抗炎介质)及白三烯(致炎介质)的关键酶,调控抗炎与致炎平衡,参与DPN过程;抑制LOX活性,可减少炎症反应,改善DPN 症状[2-6]。临床研究表明,电针足三里、肾俞可显著改善DPN 周围神经功能[7-8]。本实验观察电针对 DPN 大鼠机械痛敏反应及脊髓LOX的影响,探讨电针治疗DPN的脊髓中枢机制。1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性 SD 大鼠 30 只,5~6 周龄,体质量

220~250 g,上海斯莱克实验动物责任有限公司,动物许可证号 SCXK(沪)2012-0002。饲养于福建中医药大学 SPF级实验动物中心,分笼适应性喂养1 周。将大鼠称重并编号。所有实验均遵照国际动物保护和使用指南的规定实施。

1.2 主要试剂与仪器

链脲佐菌素(STZ),美国 Sigma 公司。华佗牌

0.28 mm×15 mm一次性针灸针、电针治疗仪,苏州

医疗用品厂有限公司。脂氧素(LXA4,货号 90410),美国 Cayman 公司。黄芩素(货号 S2268),美国 Selleck公司。LOX引物,上海生工生物工程有限公司合成。

IQ5多重实时荧光定量PCR 仪,美国 Bio-Rad 公司。

38450-电子触觉测量仪(电子 Von Frey),意大利 Ugo Basile 公司。

1.3 分组及造模实验大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、电针组、脂氧素组、黄芩素组,每组6只。模型组采用腹腔注射STZ(按60 mg/kg溶于pH 4.5 的 0.1 mol/L

柠檬酸缓冲液),尾静脉采血检测血糖≥16.7 mmol/L为标准,建立DPN 动物模型[9],不干预;电针组选取“肾俞”“足三里”电针刺激 2 周;脂氧素组脊髓鞘内注射 LXA4 3次;黄芩素组脊髓鞘内注射黄芩素3次。成模后,第1、14日观察机械痛行为学变化。

1.4 干预

参照大鼠穴位图谱取穴[10],取双侧“肾俞”“足

三里”,电针治疗(2 Hz/100 Hz交替,强度≤1 mA;时间 30 min)。室温将大鼠躯干固定于木架上,头部与四肢可自由活动,静置20 min后,将一次性针灸针刺入大鼠穴位,通过电针治疗仪给予疏密波刺激,强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜。

1.5 脊髓鞘内注射大鼠取俯卧位,实验者食指定位于大鼠脊柱 L5-6间隙,右手持微量注射器从间隙垂直缓慢进针,以大鼠尾巴出现颤动或突然侧向甩动作为穿刺成功的标

志,注入相应的药物(LXA4、黄芩素)。成模后第1、

7、14 日分别注射 1 次,其中黄芩素每次注射 10 μL (浓度为 10 μg/μL),LXA4 每次注射10 μL(浓度为

0.1 μg/μL)。

1.6 机械痛行为测试

测试环境为10 cm×20 cm×20 cm有机玻璃笼,将大鼠放入笼内静置10 min后,采用电子佛莱毛法进行检测,即利用不同强度的纤毛刺激大鼠足掌中心部位,引起大鼠缩爪反应。能引起缩爪反应的最小纤毛压力即为大鼠的缩爪反应阈值(g),以此反映大鼠机械痛敏情况。

1.7 脊髓脂氧合酶、坐骨神经髓鞘碱性蛋白检测

第 14 日行为测试结束后,迅速新鲜取材脊髓

(L4-5)背角、坐骨神经置于液氮中,-80 ℃冰箱保存待测。

ELISA 检测坐骨神经 MBP 表达。①各组坐骨神

经组织匀浆离心,取上清液;②96孔酶标板加样,每孔加入标准品或待测样品各100 μL,将反应板充分混匀后置 37 ℃ 40 min;③用洗涤液将反应板充分洗涤

4~6次,滤纸印干;④每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各 50 μL(空白除外),将反应板充分混匀后置于

37 ℃ 20 min;⑤按③步骤再次洗板;⑥每孔加酶标

抗体工作液 100 μL,将反应板置 37 ℃ 10 min,再次洗板;⑦每孔加底物工作液100 μL,置于 37 ℃暗处反应 15 min;⑧每孔加入 100 μL 终止液混匀,30 min内于酶标仪 450 nm波长处测吸光值,绘制标准曲线,根据样品OD值计算相应MBP含量。

RT-PCR 检测脊髓 LOX 基因表达。组织总 RNA提取:冰浴取出新鲜脊髓背角组织,每 50~100 mg组织加1 mL Trizol 试剂,冰浴超声匀浆15~20 s;每

1 mL Trizol 试剂加 0.2 mL氯仿,快速震荡15 s,冰浴

5 min,4 ℃、12 000×g 离心 15 min;加入等体积预冷异丙醇,混匀,冰浴15 min,4 ℃、12 000×g离心 10 min,弃上清液,吸干异丙醇;加入75%乙醇,

重悬沉淀,4 ℃、7500×g 离心8 min,弃上清液,消毒滤纸上吸干乙醇;重复以上步骤,倾去乙醇,空气干燥;干燥后将沉淀溶于DEPC 水,置于 70 ℃贮存,沉淀加乙醇于20 ℃贮存;取4 μL 总 RNA溶液稀释至 1 mL,紫外分光光度计检测 OD260和 OD280值,测定其浓度和纯度。

反转录合成 cDNA 第一链:PCR 管中依次加入Total RNA、Oligo ( dT ) 15 primer、DEPC H2O

(RNase-free),70 ℃变性 5 min,冰浴 5 min;随后加入 5×M-MLV Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs、RNase inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase、DEPC H2O,37 ℃ 水浴 60 min,95 ℃水浴5 min,冰浴 5 min。

PCR 扩增:PCR 管中依次加入 2 μL Taq PCR Master Mix、Sense primer、Antisense primer、反转产物、dd H2O,混匀,瞬时离心。94 ℃ 5 min,94

45 s,57 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min;时荧光定量PCR仪进行样本分析。

1.8 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s表示,符合正态分布用方差分析,不符合正态分

布用秩和检验中独立样本比较。检验水准α=0.05。2 结果2.1 电针对模型大鼠机械痛行为的影响与正常组比较,模型组大鼠第1、14 日机械痛阈

值均显著降低(P<0.01);与模型组比较,第 14 日电针组、脂氧素组、黄芩素组鼠机械痛阈值显著升高

(P<0.01)。见图 1。

2.2 电针对模型大鼠坐骨神经髓鞘碱性蛋白含量的影响

成模后第 14 日,与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经 MBP 含量显著降低(P<0.01);与模型组比 较,电针组、脂氧素组、黄芩素组坐骨神经 MBP 含

量显著升高(P<0.01)。见图 2。

2.3 电针对模型大鼠脊髓脂氧合酶 mRNA 表达的影响

成模后第 14 日,与正常组比较,模型组大鼠脊髓 5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA表达均显著上调

(P<0.01);与模型组比较,电针组和黄芩素组大鼠

5-LOX、12-LOX、15-LOX mRNA 表达均显著下调

(P<0.01),脂氧素组大鼠 5-LOX mRNA 表达显著

降低(P<0.01)。见图 3。

3 讨论

DPN临床表现为肢体麻木、刺痛等,属中医学“消渴”“痹证”范畴,其病机为肾脏阴阳两虚、经络痹阻。阳明为五脏六腑之海,主润宗筋,阳明实则筋骨皮脉得养,经络得通而痛止,故临床 DPN 取穴治疗常以“补益阳明,强肾通络”为主。足三里为阳明经之要穴,具有疏经益气、补肾益精作用,电针足三里、肾俞治疗 DPN 临床疗效明确;实验研究显示,电针“足三里”“肾俞”可显著改善DPN大鼠坐骨神经传导速度、增加神经营养因子,减轻氧化应激和轴突变

性、脱髓鞘程度等[11-13]。

MBP 是一种位于致密髓鞘与髓核中的多肽,可与髓鞘脂质结合,维持髓鞘结构和功能的稳定,促进髓鞘的形成。研究表明,DNP大鼠后肢可出现显著的

痛敏反应[14],坐骨神经 MBP 蛋白表达显著降低[15];外周血清MBP升高或坐骨神经MBP降低常可反映周

围神经损害的范围和严重程度[16-17]。本研究同样显示,DPN大鼠足底出现明显机械痛敏反应,坐骨神经MBP含量显著降低,电针“肾俞”“足三里”可显著抑制痛觉,促进坐骨神经髓鞘修复。

LOXs 是一类非血红素铁蛋白的多功能酶,广泛分布于哺乳动物脊髓、周围神经等组织中,主要以花生四烯酸(AA)为作用底物。根据底物加氧点的位置不同,主要分为 5-LOX、12-LOX、15-LOX。LOXs可催化AA生成内源性抗炎脂类介质脂氧素和致炎脂类介质白三烯,其异常表达可打破抗炎和致炎的平

衡,导致疾病发生[18-19]。

近年研究发现,LOXs 在 DPN及抗炎致炎中扮演着重要角色,抑制 12/15-LOX 可通过降低神经炎症反应减轻 DPN 发生发展[2-5]。此外,STZ 诱导糖尿病发生过程中,外周血液中5-LOX 及 5-LOX 激活蛋白表

达上调[20];转基因小鼠 FLAP过表达可促进脂肪组织

LXA4生成,减轻胰岛素抵抗,进一步明确LXA4 在

糖尿病中的抗炎保护作用[21]。本课题组前期研究发现,电针治疗神经痛及慢性

炎性痛,LXA4参与电针的抗炎镇痛过程,电针及黄芩素显著改变神经痛大鼠脊髓 LOX 含量而发挥抗炎

[22-23]

镇痛作用 。本实验结果同样显示,电针及

12/15-LOX 抑制剂(黄芩素)、LOX抗炎产物LXA4,可显著抑制脊髓 5-LOX、12-LOX、15-LOX,促进坐骨神经损伤修复,从而减轻机械痛敏反应。然而脊髓鞘内注射 LXA4 仅抑制 5-LOX 活性,以发挥镇痛和周围神经修复作用,并未影响 12-LOX、15-LOX 活性,其机制有待今后进一步深入研究。

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(收稿日期:2017-10-30)

(修回日期:2017-11-04;编辑:华强)

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