基于肠道菌群代谢的知母皂苷BⅡ体外代谢转化研究

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Tcm -

刘艳平1,余自成2,陈红君 2

1.上海市浦东新区人民医院,上海 201200;2.同济大学附属杨浦医院,上海 200090

摘要:目的 通过大鼠肠道菌群体外实验,观察大鼠肠道菌群对知母皂苷BⅡ的代谢转化情况。方法 收集大鼠新鲜粪便,将大鼠肠道菌加入厌氧培养液得到肠道菌孵育液,加入知母皂苷BⅡ,在厌氧环境中37 ℃温孵 24 h,经沉淀离心,取上清液,采用高效液相色谱和薄层色谱方法对知母皂苷BⅡ降解情况和代谢成分进行分析。结果 知母皂苷BⅡ在大鼠粪便孵育液中很快发生代谢转化,24 h后孵育液中已检测不到知母皂苷BⅡ,能检测出较高浓度的代谢产物。代谢产物经检测为知母皂苷AⅢ。结论离体培养的大鼠肠道菌可对知母皂苷BⅡ进行代谢,初步确定代谢产物为知母皂苷AⅢ。

关键词:知母皂苷BⅡ;大鼠肠道菌;代谢

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.015

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0066-05

Study on Metabolism and Transformation of Timosaponin BⅡ in Vitro Based on Metabolism of Intestinal Flora

LIU Yan-ping1, YU Zi-cheng2, CHEN Hong-jun2

1. Pudong New Area People’s Hospital, Shanghai 201200, China;

2. Yangpu Hospital of Tongji University, Shanghai 200090, China

Abstract: Objective To observe metabolic transformation of Timosaponin BⅡ in intestinal flora of rats by rat intestinal flora in vitro. Methods After the fresh rat feces were collected, the intestinal bacteria were added to the anaerobic medium to obtain the intestinal bacteria incubation fluid. Timosaponin BⅡ was added and cultured, and incubate at 37 ℃ in anaerobic environment for 24 h. Then samples were gathered through deposition and centrifugation. The supernatant was analyzed by HPLC and TLC method, and the degradation rate and metabolic components of Timosaponin BⅡ were analyzed. Results In vitro, Timosaponin BⅡ was metabolized by the intestinal flora soon and it could not be detected in the incubation fluid after 24 h, which could detect a higher concentration of metabolites. The metabolites preliminary identified as Timosaponin AⅢ. Conclusion Rat intestinal flora in vitro have metabolism effect on Timosaponin BⅡ. The metabolites are initially identified as Timosaponin AⅢ.

Keywords: Timosaponin BⅡ; intestinal bacteria; metabolize

知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎,味苦、性寒,具有清热泻火、止渴除烦、滋阴润燥等功效,临床用于高热烦渴、外感热病、内热消渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、肠燥便秘等。知母皂苷 BⅡ(Timosaponin BⅡ,TBⅡ)是知母中的主要活性成分,具有抗老年痴呆、改善学习记忆、抗抑郁、抗肿瘤、抗炎、降糖等药理活性[1-2]。

基金项目:上海市杨浦区科技委卫计委科研课题(YP15Q05);

同济大学青年优秀人才培养行动计划(2015KJ049);上海市

杨浦区中心医院院级课题(Se1201509)

多种天然产物口服后可被肠道菌群代谢,有些天然产物经肠道细菌代谢后转化为具有更强活性药理或毒理作用的新化合物,因此,许多天然药物以前体药形式存在,肠道菌群在其代谢中发挥着至关重要的作用。天然药物代谢反应中最重要的是糖苷的水解, β-糖苷酶是催化这类反应的最常见水解酶,可以将外源性 β-糖苷类化合物转化为相应的苷元和糖。由于TBⅡ属于 β-糖苷类化合物(结构见图 1),因此我们推测它可能会被肠道菌产生的β-糖苷酶代谢。本实验采用离体肠道菌孵育的方法,将 TBⅡ用大鼠肠道菌的培养液在厌氧条件下温孵,考察其在肠道中代谢转

化的一般规律,以 HPLC 定性分析 TBⅡ在大鼠肠道菌群中的代谢情况,并推测代谢产物的结构,探讨TBⅡ在胃肠道内的代谢转化,以期为知母的体内药效物质基础研究及临床应用开发提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100 高效液相色谱仪(Agilent 公司),

Alltech3300 蒸发光散射检测器(美国 Grace 公司),

MS204S 梅特勒电子分析天平(北京梅特勒仪器系统

有限公司),MCO-15AC CO2培养箱(三洋电机株式会

社),DK-S22 电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有

限公司),MTN-2800D 氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器

有限公司),MSL-3780 高压蒸汽灭菌锅(三洋电机株式会社),ALLEGRA X-30R离心机(Beckman Coulter)。

TBⅡ(批号 B21657,纯度≥98%),上海源叶生物有限公司;知母皂苷AⅢ(TAⅢ,批号 17050329,

纯度≥98%),上海同田生物有限公司;厌氧培养液(批号 20170613)、厌氧培养袋(批号 20161225)、厌氧产气包(批号 20170615),上海哈灵生物公司;动物粪便采于 SD 雄性大鼠;乙腈(色谱纯),美国Fisher 公司;其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 知母皂苷BⅡ色谱条件色谱柱:AlltimaTM C18 柱(4.6 mm×250 mm,

5 μm);流动相:乙腈-水(25∶75);流速:1 mL/min;检测器:蒸发光散射检测器,温度为 60 ℃,雾化气体流速为 1.5 L/min;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。

2.1.2 知母皂苷AⅢ色谱条件色谱柱:AlltimaTM C18 柱(4.6 mm×250 mm,

5 μm);流动相:甲醇-水(85∶15);流速:1 mL/min;检测器:蒸发光散射检测器,温度为 60 ℃,雾化气体流速为 1.5 L/min;柱温:25 ℃;进样量:20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 知母皂苷BⅡ对照品溶液

精密称取TBⅡ对照品 17.6 mg,溶于 30%丙酮溶液 10 mL中,即配制成浓度为 1.76 mg/mL 的TBⅡ对照品溶液,置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2.2知母皂苷AⅢ对照品溶液

精密称取TAⅢ对照品 12.1 mg,溶于 10 mL甲醇溶液中,即配制成浓度为 1.21 mg/mL 的TAⅢ对照品溶液,置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.3 厌氧培养液的制备

取 GAM肉汤约 15 g置烧杯中,加适量纯水,水浴中搅拌使溶解,冷却后转移并定容至1000 mL容量瓶中,即得GAM 培养液,0.07 MPa、121 ℃高压灭菌 15 min,冷却后备用。

4 大鼠肠道菌孵育液的制备取健康大鼠的新鲜粪便10 g,按质量体积比 1∶4

加入生理盐水制成混悬液,4000 r/min 离心 10 min,取上清液,得大鼠肠道菌液。将大鼠肠道菌液按体积比 2∶3 加入厌氧培养液中,混匀后即得大鼠肠道菌孵育液。

5 色谱方法的建立

5.1 线性关系考察

取 1.628 mg/mL TBⅡ对照品溶液,加入预先

21 ℃高压灭菌15 min的大鼠肠道菌孵育液中,逐级稀释,分别配制浓度为 40.7、108.5、407、814、1085、

628 μg/mL 的对照品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件测定,结果TBⅡ在 40.7~1628 μg/mL 范围内与峰面积的对数线性关系良好,回归方程为 Y=1.227 9X+

635 5,r2=1。

5.2 专属性考察分别对空白肠道菌孵育液、TBⅡ对照品溶液和BⅡ肠道菌孵育液中待测成分的色谱专属性进行考察分析,结果表明,TBⅡ对照品溶液和TBⅡ肠道菌孵育液中 TBⅡ的保留时间一致,空白肠道菌孵育液在相同保留时间无该色谱峰,空白肠道菌孵育液不干扰该成分的测定。色谱图见图2。

2.5.3 精密度试验

取 175.8 μg/mL的含预先121 ℃高压灭菌15 min的肠道菌培养液的对照品溶液20 μL,按“2.1.1”项下色谱条件,连续进样 6 次,计算峰面积 RSD=

1.72%,表明仪器精密度良好。

2.5.4 加样回收率试验取同一已知含量的121 ℃高压灭菌15 min 的含TBⅡ大鼠肠道菌培养液9份,分别每3份加入80%、

100%、120%对照品溶液,测定TBⅡ含量,计算低、中、高3种浓度的加样回收率分别为103%、105%、

102.6%。

2.5.5 重复性试验

取 6 份 5 mL大鼠肠菌培养液,加入2 mL浓度为

1.76 mg/mL 的TBⅡ对照品溶液,混匀,置于 37 ℃恒温培养箱培养4 h,分别取出 0.5 mL,加入 0.5 mL冰乙腈终止反应,涡旋振荡2 min,10 000 r/min 离心

10 min,取上清液 0.5 mL,于 37 ℃水浴上氮气流吹干。残渣用30%丙酮 100 μL 溶解,14 800 r/min 离心

15 min,取上清液,进行 HPLC 分析,测得 TBⅡ含量 RSD=2.48%。

2.6 知母皂苷BⅡ在大鼠肠道菌培养液中的代谢取上述大鼠肠道菌孵育液5 mL,加入 2 mL 浓度为 1.76 mg/mL 的TBⅡ对照品溶液,混匀,将溶液分装(每管 0.5 mL),同时设阴性对照组(不加TBⅡ的大鼠肠道菌孵育液,排除大鼠粪便中其他成分和厌氧培养液中成分的干扰)和空白对照组(TBⅡ对照品溶液+厌氧培养液,排除厌氧培养液对TBⅡ的干扰),每组重复 2 份。将各组置于培养系统中,37 ℃恒温培养箱密闭培养 0、1、2、4、8、12、24 h,于各时间点分别取出各样品,加 0.5 mL 冰乙腈终止反应,涡旋振荡 1 min,10 000 r/min 离心 10 min,取上清液 0.5 mL,置于氮吹仪上,37 ℃水浴氮气流吹干。残渣用30%丙酮100 μL溶解,14 800 r/min 离心10 min,取上清液进样分析,测定TBⅡ含量,计算TBⅡ的剩

余率与转化率。剩余率(%)=Cn÷C0×100%,转化

率(%)=(C0-Cn)÷C0×100%,式中 Cn为第n个 时间点的TBⅡ浓度,C0为0 h 的TBⅡ浓度。另取一部分样品残渣,用甲醇100 μL 溶解,14 800 r/min 离心 10 min,取上清液,进行 HPLC 和 TLC 分析,根据对照品初步鉴定代谢产物。

3 结果

3.1 知母皂苷 BⅡ在大鼠肠道菌培养液中的代谢转化分析

TBⅡ在大鼠肠道菌孵育液中 24 h的代谢情况见表1、图 3~图5。厌氧培养液对TBⅡ的代谢转化无影响,厌氧培养液与TBⅡ温孵 24 h含量基本不变,见图 6。大鼠粪便中其他物质和厌氧培养液残留成分也无干扰。TBⅡ在与大鼠肠道菌共孵育的过程中,代谢率的变化经过了2个时期:急速增加期(0~8 h)、

平稳期(8~24 h)。TBⅡ与肠道菌共孵育 24 h后已经检测不到 TBⅡ。以 0 h 时 TBⅡ的含量作为 100%, TBⅡ在 1、2、4、8、12、24 h的剩余率分别为 70.4%、

51.8%、34.8%、7.9%、3.2%、0%。以 0 h 时TBⅡ的代谢产物作为0%,TBⅡ在 1、2、4、8、12、24 h 的转化率分别为 29.6%、48.2%、65.2%、92.0%、96.8%、

100%。

3.2 知母皂苷 BⅡ在大鼠肠道菌孵育液中的代谢产物检测

3.2.1 高效液相色谱检测

采用 HPLC 检测代谢产物是否为 TAⅢ。分别精密吸取处理后的TBⅡ肠道菌孵育液与TAⅢ对照品溶液各 20 μL,按“2.1.2”项下色谱条件进样,结果样品图谱中与对照品在相同的保留时间显示同一个色谱峰,初步鉴定代谢产物为 TAⅢ。各时间点 HPLC图见图7。

3.2.2 薄层色谱检测

将“2.6”项下的 24 h孵育液迅速加入 0.5 mL 冰乙腈终止反应,涡旋振荡2 min 后,10 000 r/min 离心

10 min,取上清液 0.5 mL,于 37 ℃水浴上氮气流吹干。残渣用100 μL甲醇溶解,14 800 r/min 离心10 min,取上清液,进行薄层色谱分析。

分别吸取甲醇复溶的样品溶液、TAⅢ对照品溶液和阴性对照溶液(不加 TBⅡ的大鼠肠道菌孵育液)各5 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以CHCl3-MeOH-H2O

(70∶15∶2)为展开剂展开,喷以香草醛硫酸试液,于 105 ℃加热至斑点显色清晰。结果样品色谱中与对照品 TAⅢ在相同位置上显相同颜色的斑点,阴性对照在相同位置上无相应斑点。由此可初步判断代谢产物为TAⅢ。

图 1 TBⅡ结构图

图6 TBⅡ在厌氧培养液中的稳定性

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