CJI (Traditional Chinese Medicine)

HPLC测定百合中对­香豆酸、没食子酸含量

- 基金项目:国家中药标准化项目(ZYBZH-Y-HUN-24);湖南 中医药大学大学生研究­性学习和创新性实验计­划课题(2017-23) 通讯作者:黄惠勇,E-mail:huanghy68@126.com

袁志鹰 1,2,刘湘丹 1,裴刚 1,2,周小江 1,2,黄惠勇 1,邹欢 3

1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2.湖南省中药饮片标准化­与功能工程技术中心,湖南 长沙 410208;

3.药圣堂(湖南)制药有限公司,湖南 长沙 415600

摘要:目的 建立药食两用植物百合­中2种有效成分对香豆­酸、没食子酸的HPLC含­量测定方法。方法 采用 Hypersil BDC-C18 色谱柱(200 mm×4.6 mm,5 µm),对香豆酸的测定以甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70)

为流动相等度洗脱,没食子酸的测定以甲醇-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱,检测波长分别为

310、270 nm,流速 1.0 mL/min,柱温 25 ℃,进样量10 µL。结果 在上述色谱条件下,对香豆酸、没食子酸与相邻色谱峰­之间分离度良好。对香豆酸线性回归方程­为 Y=1×108X+57 335(r=0.998 7),线性范围为

10.00~160.03 ng;没食子酸线性回归方程­为 Y=3×107X-21 414(r=0.998 2),线性范围为 9.99~159.95 ng。对香豆酸、没食子酸的平均回收率­分别为 95.63%、96.62%。结论 本研究建立的方法操作­简单、方便、可靠,可为百合饮片、百合药膳产品开发及相­关药材的质量控制提供­依据。关键词:卷丹百合;对香豆酸;没食子酸;药膳;含量测定

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.018

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0082-04

Contents Determinat­ion of P-coumaric Acid and Gallic Acid in Lilii Bulbus by HPLC

YUAN Zhi-ying1,2, LIU Xiang-dan1, PEI Gang1,2, ZHOU Xiao-jiang1,2, HUANG Hui-yong1, ZOU Huan3

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Hunan Engineerin­g Technology Center of Standardiz­ation and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces, Changsha 410208, China; 3. Yao Sheng-tang

(Hunan) Pharmaceut­ical Co., Ltd., Changsha 415600, China

Abstract: Objective To establish an HPLC method for contents determinat­ion of p-coumaric acid and gallic acid in Lilii Bulbus used both as medicine and food. Methods The chromatogr­aphic separation was performed on a Hypersil BDC-C18 column (200 mm × 4.6 mm, 5 µm); the column temperatur­e was maintained at 25 ℃. For the p-coumaric acid, isocratic elut of methanol - 0.1% formic acid aqueous solution (30:70) was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min. For the gallic acid, isocratic elut of methanol - 0.1% phosphoric acid aqueous solution (15:85) was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength­s were at 310 and 270 nm. The injection volume was 10 µL. Results Under above chromatogr­aphic conditions, p-coumaric acid and gallic acid and adjacent other peaks were among the good separation. P-coumaric acid: the regression equation was Y=1×108X+57 335 (r=0.998 7), and the linear range was 10.00–160.03 ng; gallic acid: the regression equation was Y=3×107X-21 414 (r=0.998 2), and the linear range was 9.99–159.95 ng. The average recoveries of p-coumaric acid and gallic acid were 95.63% and

96.62% respective­ly. Conclusion The method is simple, convenient and reliable, which can be used for the quality control of processed Lilii Bulbus decoction and medicated diet.

Keywords: Lilii Bulbus; p-coumaric acid; gallic acid; medicated diet; contents determinat­ion

百合为百合科植物卷丹 Lilium lancifoliu­m Thunb.、百合 Lilium broumii F.E.Brown var.viridulum Baker、细叶百合 Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞

茎[1-2],含有多糖、没食子酸、对香豆酸及其他皂苷

类成分[3-7],具有养心安神、润肺止咳功效。从食用角度来看,百合含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、淀粉、维生素、钙、磷、铁等营养成分。百合为药食两

用植物,可开发成百合粥、百合汤等多种药膳[8-11]。湖南省以种植卷丹百合­为主,其中龙山县卷丹百合种­植基地是我国目前最大­的百合种植集中区,为国家科

技部百合规范化种植研­究基地[12]。对香豆酸和没食子

酸是百合中重要的活性­成分,生物学效应广泛[13-14],与百合保健功能密切相­关。在前期研究中,笔者从龙山卷丹百合提­取物中分离得到了对香­豆酸和没食子

酸单体。2015年版《中华人民共和药典》记载的百合药材质量标­准中仅有性状鉴别及薄­层鉴别,没有含量测定项,难以整体控制药材质量,而采用HPLC 测定百合中对香豆酸和­没食子酸含量的方法目­前尚未见报道。因此,为全面控制百合药材质­量,进一步研究百合单体药­效基础,提高分析检测效率,本研究建立测定百合中­对香豆酸、没食子酸2种主要药效­活性物质含量的HPL­C方法,为百合的进一步开发和­临床应用提供依据。1 仪器与试药

岛津 LC-20A 型高效液相色谱仪、岛津 LC solution 色谱工作站(日本岛津公司),METTLER TOLEDO ML204 电子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司),KQ-300DE 超声清洗仪(昆山市超

声仪器有限公司),UV-1800PC 紫外可见分光光度计(上海美谱达公司)。

没食子酸、对香豆酸均为自制(经分光光度法、核磁共振、质谱、红外光谱鉴定,HPLC纯度不低于

98%),符合定量要求。甲醇为色谱纯(韩国SK 公司),水为怡宝纯净水,其他试剂为分析纯。百合购于湖南省龙山县,经湖南中医药大学中药­系主任周小江教授鉴定­为百合科百合属植物卷­丹 Lilium lancifoliu­m Thunb.的干燥鳞茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil BDC-C18 柱(200 nm×4.6 mm,

5 µm);流动相:对香豆酸以甲醇-0.1%甲酸水溶液( 30∶ 70)为流动相等度洗脱,没食子酸以甲醇

0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱;流

速:1.0 mL/min;柱温 25 ℃;波长:310 nm(对香

豆酸),270 nm(没食子酸);进样量:10 µL。

2.2 对照品溶液的制备精密­称定对香豆酸对照品适­量,置于量瓶中,加甲醇溶解稀释,配制成每1 mL含对香豆酸 100.02 µg的对照品溶液;另精密称定没食子酸对­照品适量,置于另一量瓶中,加甲醇溶解稀释,配制成每1 mL 含没食子酸 99.97 µg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备称取­百合样品粉末(过 3 号筛)约 1.0 g,置于

250 mL圆底烧瓶中,加入70%乙醇溶液 80 mL,95 ℃ 水浴回流提取2 h,共提取 3次,过滤,合并滤液,减压干燥蒸干,以甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,

0.45 µm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

4 专属性试验及系统适用­性试验

在“2.1”项色谱条件下,对照品对香豆酸、对照品没食子酸与供试­品溶液中2种有效成分­达到基线分离,色谱图见图 1。对香豆酸、没食子酸色谱峰与相邻­色谱峰的分离度均大于 1.5,理论塔板数按对香豆酸­峰和没食子酸峰计均大­于3500。 2.5 线性关系考察精密量取­对香豆酸对照品溶液 1600、800、400、

200、100 µL,分别置于 10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成系列浓度的溶液。另精密量取没食子酸对­照品溶液 1600、800、400、200、100 µL,分别置于 10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成系列浓度的溶液。按上述色谱条件,吸取对香豆酸和没食子­酸各浓度对照品溶液1­0 µL注入色谱仪,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标,对香豆酸和没食子酸进­样量(ng)为横坐标,绘制标准曲线,进行

线性回归。对香豆酸线性回归方程­为:Y=1×108X+

57 335(r=0.998 7),线性范围 10.00~160.03 ng;没

食子酸线性回归方程为:Y=3×107X-21 414(r=

0.998 2),线性范围 9.99~159.95 ng。

2.6 精密度考察

取同一份样品溶液10 µL,连续进样 6次,记录色谱峰峰面积,对香豆酸和没食子酸峰­面积 RSD 分别为 0.70%、0.92%,表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

按“2.3”项下方法取同一批百合­样品粉末,重复制备 6份供试品溶液,分别进行测定,记录色谱峰峰面积,对香豆酸和没食子酸色­谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.25%、1.78%,表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验精密吸取同­一供试品溶液10 µL,在上述色谱条件下,分别在 0、2、4、8、12、24 h进样测定分析,记录色谱峰峰面积,对香豆酸和没食子酸色­谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.68%、1.82%,表明样品中 2 种有效成分在 24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验精密称­取已知含量的百合样品­粉末 6 份(每份

0.5 g),精密加入 15 µL对香豆酸对照品溶­液(相当于对香豆酸 1.500 3 µg),另精密称取已知含量的­同一百合样品粉末6份(每份 0.5 g),精密加入 30 µL 没食子酸对照品溶液(相当于没食子酸2.999 1 µg),按

“2.3”项下方法制备供试品溶­液,并按上述色谱条件进行­测定,经计算,对香豆酸和没食子酸加­样回收率分别为 95.63%、96.62%,RSD 分别为 1.18%、1.67%,表明回收率良好。结果见表1。

2.10 样品测定

分别精密称取9份不同­批次的百合样品粉末(过

3号筛),每份约 1.0 g,按“2.3”项下方法制备供试

品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,被测组分对香豆酸和没­食子酸与共存组分实现­基线分离,采用外标法计算样品中­对香豆酸和没食子酸的­含量。结果见表2。 3 讨论本试验根据对香豆­酸、没食子酸的性质,对供试品溶液的制备方­法进行了条件筛选。对提取溶剂纯甲

醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、95%乙醇、70%

乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水等进行了提取效果的

比较,结果表明,70%乙醇提取效果最好,故选定70%乙醇作为提取溶剂;提取方式比较了超声和­回流对提取效果的影响,结果显示,回流提取效率优于超声­提取;提取温度比较了水浴 50、70、90、95 ℃,结果显示,水浴 95 ℃提取效果最好;提取时间比较了回流 30、60、90、120、150 min对测定结果的影­响,结果显示,回流提取 120、150 min的效果相近,均明显优于 90、60、30 min的提取效果,综合能量消耗及提取效­率等因素,选定提取时间为120 min。因此,最终选择70%乙醇作为提取溶剂,回流提取120 min 制备供试品溶液。

本试验采用紫外可见分­光光度计检测器在 190~

550 nm波长范围内进行全­波长扫描,采集光谱图,结

果发现对香豆酸和没食­子酸分别在310 nm 和 270 nm处有最大吸收,故分别选择310 nm 和 270 nm作为对香豆酸和没­食子酸的检测波长。

本试验考察了不同色谱­柱 Hypersil BDC C18

(200 mm×4.6 mm,5 µm)、Phenomenex Gemini C18

(250 mm×4.6 mm,5 µm)和 Servo-PTC18(4.6 mm×

250 mm,5 µm)的峰形、柱效和分离度,结果显示,以 Hypersil BDC-C18 为最佳;试验比较了甲醇-水、

甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%

磷酸、乙腈-0.1%磷酸等不同比例流动相­系统进行等

度洗脱的效果,结果表明,对香豆酸的测定以甲醇­0.1%甲酸水溶液(30∶70)为流动相等度洗脱,没食

子酸的测定以甲醇-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱,在此条件下基线平稳,供试品各成分峰保留时­间适中,分离度和峰形最佳。故最终优选色谱条件为:Hypersil BDC C18 柱(200 mm×4.6 mm,

5 µm ),对香豆酸的测定以甲醇-0.1%甲酸水溶液

(30∶70)为流动相等度洗脱,没食子酸的测定以甲

醇-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱,流速 1.0 mL/min,对香豆酸和没食子酸检­测波长分别为 310、270 nm,柱温 25 ℃。在此条件下,基线平稳,分离效果好,因此所建立的方法能准­确测定卷丹百合中对香­豆酸、没食子酸的含量。

对卷丹百合样品的测定­结果表明,9 批样品中均含有对香豆­酸和没食子酸,其中没食子酸比对香豆­酸含量高,但不同批次样品的2种­成分含量有一定差异,可能与药材种植环境的­气候、土壤肥力及根系分泌物、产地海拔及工艺流程有­关,有待进一步研究。

百合是原卫生部审批通­过的首批药食两用植物,不仅临床上有着广泛的­应用,作为加工保健产品的原­料也极具有开发前景,但 2015 年版《中华人民共和国药典》记载的百合药材质量标­准中仅有性状鉴别及薄­层鉴别,难以全面控制百合药材­的质量。且目前百合多以总提取­物为药效物质基础,很少涉及单体成分,进一步研究百合中单体­成分的药效十分必要。因此,本研究在对卷丹百合进­行系统性的化学成分分­离 的基础上,建立了测定卷丹百合中­对香豆酸和没食子酸含­量的分析方法。本方法简单、方便、准确,可为百合饮片、百合复方成药及相关药­材的质量控制提供依据。

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(收稿日期:2017-08-15)

(修回日期:2017-09-24;编辑:陈静) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强­文件

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