HPLC测定百合中对香豆酸、没食子酸含量

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - Chinese Journal Of Information On Tcm - 基金项目:国家中药标准化项目(ZYBZH-Y-HUN-24);湖南 中医药大学大学生研究性学习和创新性实验计划课题(2017-23) 通讯作者:黄惠勇,E-mail:huanghy68@126.com

袁志鹰 1,2,刘湘丹 1,裴刚 1,2,周小江 1,2,黄惠勇 1,邹欢 3

1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2.湖南省中药饮片标准化与功能工程技术中心,湖南 长沙 410208;

3.药圣堂(湖南)制药有限公司,湖南 长沙 415600

摘要:目的 建立药食两用植物百合中2种有效成分对香豆酸、没食子酸的HPLC含量测定方法。方法 采用 Hypersil BDC-C18 色谱柱(200 mm×4.6 mm,5 µm),对香豆酸的测定以甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70)

为流动相等度洗脱,没食子酸的测定以甲醇-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱,检测波长分别为

310、270 nm,流速 1.0 mL/min,柱温 25 ℃,进样量10 µL。结果 在上述色谱条件下,对香豆酸、没食子酸与相邻色谱峰之间分离度良好。对香豆酸线性回归方程为 Y=1×108X+57 335(r=0.998 7),线性范围为

10.00~160.03 ng;没食子酸线性回归方程为 Y=3×107X-21 414(r=0.998 2),线性范围为 9.99~159.95 ng。对香豆酸、没食子酸的平均回收率分别为 95.63%、96.62%。结论 本研究建立的方法操作简单、方便、可靠,可为百合饮片、百合药膳产品开发及相关药材的质量控制提供依据。关键词:卷丹百合;对香豆酸;没食子酸;药膳;含量测定

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.018

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0082-04

Contents Determination of P-coumaric Acid and Gallic Acid in Lilii Bulbus by HPLC

YUAN Zhi-ying1,2, LIU Xiang-dan1, PEI Gang1,2, ZHOU Xiao-jiang1,2, HUANG Hui-yong1, ZOU Huan3

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. Hunan Engineering Technology Center of Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces, Changsha 410208, China; 3. Yao Sheng-tang

(Hunan) Pharmaceutical Co., Ltd., Changsha 415600, China

Abstract: Objective To establish an HPLC method for contents determination of p-coumaric acid and gallic acid in Lilii Bulbus used both as medicine and food. Methods The chromatographic separation was performed on a Hypersil BDC-C18 column (200 mm × 4.6 mm, 5 µm); the column temperature was maintained at 25 ℃. For the p-coumaric acid, isocratic elut of methanol - 0.1% formic acid aqueous solution (30:70) was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min. For the gallic acid, isocratic elut of methanol - 0.1% phosphoric acid aqueous solution (15:85) was adopted at the flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelengths were at 310 and 270 nm. The injection volume was 10 µL. Results Under above chromatographic conditions, p-coumaric acid and gallic acid and adjacent other peaks were among the good separation. P-coumaric acid: the regression equation was Y=1×108X+57 335 (r=0.998 7), and the linear range was 10.00–160.03 ng; gallic acid: the regression equation was Y=3×107X-21 414 (r=0.998 2), and the linear range was 9.99–159.95 ng. The average recoveries of p-coumaric acid and gallic acid were 95.63% and

96.62% respectively. Conclusion The method is simple, convenient and reliable, which can be used for the quality control of processed Lilii Bulbus decoction and medicated diet.

Keywords: Lilii Bulbus; p-coumaric acid; gallic acid; medicated diet; contents determination

百合为百合科植物卷丹 Lilium lancifolium Thunb.、百合 Lilium broumii F.E.Brown var.viridulum Baker、细叶百合 Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞

茎[1-2],含有多糖、没食子酸、对香豆酸及其他皂苷

类成分[3-7],具有养心安神、润肺止咳功效。从食用角度来看,百合含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、淀粉、维生素、钙、磷、铁等营养成分。百合为药食两

用植物,可开发成百合粥、百合汤等多种药膳[8-11]。湖南省以种植卷丹百合为主,其中龙山县卷丹百合种植基地是我国目前最大的百合种植集中区,为国家科

技部百合规范化种植研究基地[12]。对香豆酸和没食子

酸是百合中重要的活性成分,生物学效应广泛[13-14],与百合保健功能密切相关。在前期研究中,笔者从龙山卷丹百合提取物中分离得到了对香豆酸和没食子

酸单体。2015年版《中华人民共和药典》记载的百合药材质量标准中仅有性状鉴别及薄层鉴别,没有含量测定项,难以整体控制药材质量,而采用HPLC 测定百合中对香豆酸和没食子酸含量的方法目前尚未见报道。因此,为全面控制百合药材质量,进一步研究百合单体药效基础,提高分析检测效率,本研究建立测定百合中对香豆酸、没食子酸2种主要药效活性物质含量的HPLC方法,为百合的进一步开发和临床应用提供依据。1 仪器与试药

岛津 LC-20A 型高效液相色谱仪、岛津 LC solution 色谱工作站(日本岛津公司),METTLER TOLEDO ML204 电子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司),KQ-300DE 超声清洗仪(昆山市超

声仪器有限公司),UV-1800PC 紫外可见分光光度计(上海美谱达公司)。

没食子酸、对香豆酸均为自制(经分光光度法、核磁共振、质谱、红外光谱鉴定,HPLC纯度不低于

98%),符合定量要求。甲醇为色谱纯(韩国SK 公司),水为怡宝纯净水,其他试剂为分析纯。百合购于湖南省龙山县,经湖南中医药大学中药系主任周小江教授鉴定为百合科百合属植物卷丹 Lilium lancifolium Thunb.的干燥鳞茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil BDC-C18 柱(200 nm×4.6 mm,

5 µm);流动相:对香豆酸以甲醇-0.1%甲酸水溶液( 30∶ 70)为流动相等度洗脱,没食子酸以甲醇

0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱;流

速:1.0 mL/min;柱温 25 ℃;波长:310 nm(对香

豆酸),270 nm(没食子酸);进样量:10 µL。

2.2 对照品溶液的制备精密称定对香豆酸对照品适量,置于量瓶中,加甲醇溶解稀释,配制成每1 mL含对香豆酸 100.02 µg的对照品溶液;另精密称定没食子酸对照品适量,置于另一量瓶中,加甲醇溶解稀释,配制成每1 mL 含没食子酸 99.97 µg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备称取百合样品粉末(过 3 号筛)约 1.0 g,置于

250 mL圆底烧瓶中,加入70%乙醇溶液 80 mL,95 ℃ 水浴回流提取2 h,共提取 3次,过滤,合并滤液,减压干燥蒸干,以甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,

0.45 µm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

4 专属性试验及系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下,对照品对香豆酸、对照品没食子酸与供试品溶液中2种有效成分达到基线分离,色谱图见图 1。对香豆酸、没食子酸色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于 1.5,理论塔板数按对香豆酸峰和没食子酸峰计均大于3500。 2.5 线性关系考察精密量取对香豆酸对照品溶液 1600、800、400、

200、100 µL,分别置于 10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成系列浓度的溶液。另精密量取没食子酸对照品溶液 1600、800、400、200、100 µL,分别置于 10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成系列浓度的溶液。按上述色谱条件,吸取对香豆酸和没食子酸各浓度对照品溶液10 µL注入色谱仪,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标,对香豆酸和没食子酸进样量(ng)为横坐标,绘制标准曲线,进行

线性回归。对香豆酸线性回归方程为:Y=1×108X+

57 335(r=0.998 7),线性范围 10.00~160.03 ng;没

食子酸线性回归方程为:Y=3×107X-21 414(r=

0.998 2),线性范围 9.99~159.95 ng。

2.6 精密度考察

取同一份样品溶液10 µL,连续进样 6次,记录色谱峰峰面积,对香豆酸和没食子酸峰面积 RSD 分别为 0.70%、0.92%,表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

按“2.3”项下方法取同一批百合样品粉末,重复制备 6份供试品溶液,分别进行测定,记录色谱峰峰面积,对香豆酸和没食子酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.25%、1.78%,表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 µL,在上述色谱条件下,分别在 0、2、4、8、12、24 h进样测定分析,记录色谱峰峰面积,对香豆酸和没食子酸色谱峰峰面积的 RSD 分别为 1.68%、1.82%,表明样品中 2 种有效成分在 24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验精密称取已知含量的百合样品粉末 6 份(每份

0.5 g),精密加入 15 µL对香豆酸对照品溶液(相当于对香豆酸 1.500 3 µg),另精密称取已知含量的同一百合样品粉末6份(每份 0.5 g),精密加入 30 µL 没食子酸对照品溶液(相当于没食子酸2.999 1 µg),按

“2.3”项下方法制备供试品溶液,并按上述色谱条件进行测定,经计算,对香豆酸和没食子酸加样回收率分别为 95.63%、96.62%,RSD 分别为 1.18%、1.67%,表明回收率良好。结果见表1。

2.10 样品测定

分别精密称取9份不同批次的百合样品粉末(过

3号筛),每份约 1.0 g,按“2.3”项下方法制备供试

品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,被测组分对香豆酸和没食子酸与共存组分实现基线分离,采用外标法计算样品中对香豆酸和没食子酸的含量。结果见表2。 3 讨论本试验根据对香豆酸、没食子酸的性质,对供试品溶液的制备方法进行了条件筛选。对提取溶剂纯甲

醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、95%乙醇、70%

乙醇、50%乙醇、30%乙醇、水等进行了提取效果的

比较,结果表明,70%乙醇提取效果最好,故选定70%乙醇作为提取溶剂;提取方式比较了超声和回流对提取效果的影响,结果显示,回流提取效率优于超声提取;提取温度比较了水浴 50、70、90、95 ℃,结果显示,水浴 95 ℃提取效果最好;提取时间比较了回流 30、60、90、120、150 min对测定结果的影响,结果显示,回流提取 120、150 min的效果相近,均明显优于 90、60、30 min的提取效果,综合能量消耗及提取效率等因素,选定提取时间为120 min。因此,最终选择70%乙醇作为提取溶剂,回流提取120 min 制备供试品溶液。

本试验采用紫外可见分光光度计检测器在 190~

550 nm波长范围内进行全波长扫描,采集光谱图,结

果发现对香豆酸和没食子酸分别在310 nm 和 270 nm处有最大吸收,故分别选择310 nm 和 270 nm作为对香豆酸和没食子酸的检测波长。

本试验考察了不同色谱柱 Hypersil BDC C18

(200 mm×4.6 mm,5 µm)、Phenomenex Gemini C18

(250 mm×4.6 mm,5 µm)和 Servo-PTC18(4.6 mm×

250 mm,5 µm)的峰形、柱效和分离度,结果显示,以 Hypersil BDC-C18 为最佳;试验比较了甲醇-水、

甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%

磷酸、乙腈-0.1%磷酸等不同比例流动相系统进行等

度洗脱的效果,结果表明,对香豆酸的测定以甲醇0.1%甲酸水溶液(30∶70)为流动相等度洗脱,没食

子酸的测定以甲醇-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱,在此条件下基线平稳,供试品各成分峰保留时间适中,分离度和峰形最佳。故最终优选色谱条件为:Hypersil BDC C18 柱(200 mm×4.6 mm,

5 µm ),对香豆酸的测定以甲醇-0.1%甲酸水溶液

(30∶70)为流动相等度洗脱,没食子酸的测定以甲

醇-0.1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相等度洗脱,流速 1.0 mL/min,对香豆酸和没食子酸检测波长分别为 310、270 nm,柱温 25 ℃。在此条件下,基线平稳,分离效果好,因此所建立的方法能准确测定卷丹百合中对香豆酸、没食子酸的含量。

对卷丹百合样品的测定结果表明,9 批样品中均含有对香豆酸和没食子酸,其中没食子酸比对香豆酸含量高,但不同批次样品的2种成分含量有一定差异,可能与药材种植环境的气候、土壤肥力及根系分泌物、产地海拔及工艺流程有关,有待进一步研究。

百合是原卫生部审批通过的首批药食两用植物,不仅临床上有着广泛的应用,作为加工保健产品的原料也极具有开发前景,但 2015 年版《中华人民共和国药典》记载的百合药材质量标准中仅有性状鉴别及薄层鉴别,难以全面控制百合药材的质量。且目前百合多以总提取物为药效物质基础,很少涉及单体成分,进一步研究百合中单体成分的药效十分必要。因此,本研究在对卷丹百合进行系统性的化学成分分离 的基础上,建立了测定卷丹百合中对香豆酸和没食子酸含量的分析方法。本方法简单、方便、准确,可为百合饮片、百合复方成药及相关药材的质量控制提供依据。

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(收稿日期:2017-08-15)

(修回日期:2017-09-24;编辑:陈静) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件

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