植物多糖分离纯化工艺研究进展

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肖瑞希,陈华国,周欣贵州师范大学,贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室,贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室,天然药物质量控制中心,贵州 贵阳 550001摘要:植物多糖因具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性和多种药用价值,近年已广泛应用于生命科学等研究领域。由于植物多糖相关研究受其油脂、蛋白质、色素等杂质影响较大,故除杂质、分离纯化技术是该领域研究开展的重要前提。本文对近年来植物多糖的脱脂、除蛋白、除色素等分离纯化方法技术的研究现状进行总结,为植物多糖的深入研究与开发提供参考。

关键词:植物多糖;除杂质;分离纯化;综述

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.034

中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)05-0136-05

Research Progress in Separation and Purification of Plant Polysaccharides

XIAO Rui-xi, CHEN Hua-guo, ZHOU Xin

Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment, Guizhou Engineering Laboratory for Quality Control&Evaluation Technology of Medicine, Research Center for Quality Control of Natural Medicine, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China

Abstract: In recent years, because plant polysaccharides are with anti-tumor, anti-virus, anti-ulcer, anti-oxidation and other unique biological activity, a variety of medicinal values have been frequently applied in the field of life sciences research. However, because plant polysaccharides research is limited by its fat, protein, pigment and other impurities, technology of impurities and separation and purification are important premise of research development in this field. This article mainly summarized the recent research on the methods of impurities, separation and purification of plant polysaccharides, which provided a reference for the further research and development of plant polysaccharides. Keywords: plant polysaccharide; impurity removal; separation and purification; review

多糖广泛存在于动植物中,它通过超过 10 个糖

苷键连接不同或相同的单糖而形成,具有抗肿瘤[1]、

抗病毒[2]、抗氧化[3]、抗溃疡[4]等活性,近年已广泛应用于生命科学等研究领域。由于植物多糖相关研究受其油脂、蛋白质、色素等杂质影响较大,故除杂质、分离纯化技术是该领域研究开展的重要前提。如何高效低损失地除杂质,获得均一的多糖,越来越受到关注。本文对近年来植物多糖的除杂质、分离纯化方法的研究现状进行综述,为植物多糖的相关研究及进一步开发利用提供参考。

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31570358);贵州省

高层次创新型人才培养项目(黔科合人才[2015]4033);贵州省科技计划项目(黔科合平台人才[2017]5625、黔科合支

撑[2018]2826);贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合 KY 字[2017]123)

通讯作者:周欣,E-mail:alice9800@sina.com 1 多糖除杂质提取后的多糖属粗多糖,常含有油脂、蛋白质、色素、盐等杂质,极大地影响植物多糖结构表征和生

物活性分析的后续工作[5-6],故除杂质对植物多糖研究具有关键作用。

1.1 脱脂植物中含有的少量油脂包裹着多糖使提取液难以渗入原料,阻碍多糖的提取,故在多糖提取之前需要脱脂。目前主要采用一定量的有机溶剂采用索氏回流提取脱脂,常用的有机溶剂为石油醚、乙醚、乙醇。

张斌等[7]研究了甘蔗渣多糖提取的最佳脱脂工艺,得

出最佳脱脂工艺条件为乙醇和乙醚(9∶1),回流时间 4 h,料液比(g∶mL)1∶25,获得甘蔗渣多糖的提取率为 1.02%。

1.2 除蛋白蛋白质与多糖均属亲水性结构复杂的大分子,在除去蛋白质的同时多糖也有所损失,因此高效低损失

除蛋白的方法越来越受关注。目前,除蛋白的方法主要有 Sevage 法、三氯乙酸法、酶解法、酶法与化学联用法等。

1.2.1 Sevage 法蛋白质在氯仿等有机溶剂中会变性而不溶于水。将植物多糖水溶液与一定配比的氯仿-正丁醇(或戊醇)溶液以5∶1 或 4∶1比例混合后,剧烈振摇20~

30 min,蛋白质变性生成凝胶状,经离心可除去变性蛋白。Wang Q Z 等[8]采用 Sevage 法除费菜多糖的蛋白,向样品中加入 Sevage 试剂(3∶1),振摇 25 min,离心除去蛋白,重复3次,蛋白质去除率和多糖损失

率分别为(61.28±0.25)%、(29.16±0.19)%。优点: Sevage法条件温和、操作简单比较常用。缺点:需重

复多次而比较耗时耗财,也不能用于除脂蛋白[9]。

1.2.2 三氯乙酸法蛋白质分子内部的疏水基团能与三氯乙酸发生作用造成蛋白质变性,相互凝聚沉淀。在多糖水溶液中加入等体积的5%~10%三氯乙酸,混匀静置过夜,

离心除沉淀,重复操作可得到脱蛋白多糖。崔錾等[10]在冰浴条件下向萝藦果壳多糖溶液中分组加入一定量的三氯乙酸溶液,使三氯乙酸最终浓度为5%、10%、

15%,于 4 ℃冰箱中过夜,4000 r/min 离心 15 min,取上清液。结果显示,三氯乙酸浓度为10%时,脱蛋白效果最佳,除蛋白率为 71.55%。优点:能有效去除蛋白。缺点:需静置过夜耗时;基于酸水解,在一

定程度上水解糖苷键[11]。

1.2.3 酶解法蛋白酶可催化水解蛋白质,能较温和地去除蛋

白。杨斌等[12]比较了三氯乙酸法、Sevage 法、木瓜蛋白酶法对蓝刺头多糖除蛋白效果,综合分析显示优化的木瓜蛋白酶法除蛋白效果最佳,除蛋白率、多糖保留率分别为 56.57%,98.12%。其最佳工艺为酶解温度 64 ℃,时间 2.6 h,pH 6.0。特点:作用温和,并能较好地保证多糖的生物活性,且多糖损失率较

低[9]。

1.2.4酶法与化学法联用法酶能较为温和地除蛋白,Sevage法、三氯乙酸法可有效除蛋白,将二者联用的方法也较为常用。苗慧

琴等[13]比较了酶-三氯乙酸法、酶-Sevage 法、酶法、三氯乙酸法、Sevage 法对山药多糖除蛋白的效果。结果表明,胰蛋白酶-三氯乙酸法脱蛋白的效果最好,蛋白脱除率为87.25%,多糖保留率为 92.48%,其最佳脱蛋白条件为胰蛋白酶用量0.4 mL、酶解时间45 min、酶解 pH 7.5、酶解温度 37 ℃。特点:与单独使用酶 法和化学法相比效率更高,溶剂处理次数相对减少,

试验耗时短,操作简单,降低成本[14]。

1.2.5 其他

除了 Sevage 法、三氯乙酸法、酶法等常用的方法外,还可采用聚酰胺法、高氯酸法、季铵盐等去除植物多糖蛋白质。Yu X H 等[11]比较了 Sevage 法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法、聚酰胺法除西洋参粗多糖的蛋白。结果表明,使用三氯乙酸和聚酰胺获得的脱蛋白率分别为 91.2%和 94.9%。然而,三氯乙酸法属酸水解,在一定程度上水解糖苷键,会破坏其性质和结构特征。因此,聚酰胺法更适用于多糖溶液脱蛋白,

[15]并且多糖损失率仅为 10.86%。常飞等 比较了Sevage 法、三氯乙酸法、Sevage-三氯乙酸法、HClO4法对贵州野生甜藤多糖去蛋白的效果。结果表明,

HClO4法脱蛋白效果最佳,经3次脱蛋白处理后蛋白脱出率为 94.78%,多糖损失率为 15.14%。该方法适用于除甜藤植物多糖中的蛋白质,工艺简单,成本低,易于提纯,且对环境友好。Zhou H L 等[16]研究用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)去玉米丝多糖蛋白的最佳条件。当 NaCl 0.010 g、pH 6.0、CTAB 体积比为

10%、解离时间24 h时,得到最佳脱蛋白率为58.17%,多糖保留率为 25.29%,多糖的纯度同时从 6.445%提高到 20.3%。

1.3 除色素除油脂、蛋白质外,色素也是植物多糖的杂质之一。蛋白去除后,常用活性炭吸附法、双氧水法、大孔吸附树脂法、离子交换树脂法等除去植物多糖中的色素。

1.3.1 活性炭吸附法活性炭具有多孔结构,其表面含的有氧化物或络合物可以与被吸附的物质发生结合,而具有较强的吸

附力。张丽红等[17]利用活性炭对紫苏叶多糖提取液进行脱色。当活性炭用量为 0.58%(M/V)、pH 6.0、温度 50 ℃、时间 15 min 时,脱色率达 99.99%,多糖损失率为5.05%。优点:操作简单、成本低、应用广泛。缺点:活性炭在脱色后难滤除。

1.3.2 双氧水法双氧水法是利用氧化性,使有色物质的分子氧化

失去原有色素。秦亚东等[18]比较了粉末活性炭、颗粒活性炭、过氧化氢、次氯酸钠对白芍多糖脱色效果。过氧化氢脱色效果最好,多糖保留率和脱色率分别为

72.26%、82.55%;其最佳脱色条件为 65 ℃,3.5 h, pH 9,过氧化氢体积分数20%。优点:脱色效果较好。缺点:具有强氧化性,破坏多糖结构而损失多糖。

1.3.3大孔吸附树脂法大孔吸附树脂具有大孔网状结构和较大的比表面积,可有选择地通过物理性质吸附物质。杨新河

等[19]采用 D101树脂对普洱茶多糖同时脱色和除蛋白质,当普洱茶多糖溶液体积为50 mL时,在pH 4、

50 ℃、料液质量浓度 3.8 mg/mL、树脂用量 11 mL的条件下,普洱茶多糖的脱色率为 82.33%、脱蛋白率为 70.89%。Yang R 等[20]通过大孔树脂从南瓜残渣发酵液中纯化粗多糖。研究了不同极性、直径和表面积的 6 种树脂(AB-8、S-8、HpH480、HPD100、X-5和 D101)同时脱色和脱蛋白的效果,结果表明 S-8最佳,色素和蛋白质的吸附率分别为84.3%和 75.9%,多糖的回收率为84.7%;经分析,大多数色素和蛋白质被 S-8树脂吸收,也没有降解多糖。特点:与化学脱色方法相比容易再生,可同时脱色、脱蛋白,且几乎不发生多糖降解。

1.3.4 离子交换树脂法离子交换剂对不同离子有不同的吸附能力和置换能力,可选择性地发挥作用。Jiang H Y 等[21]采用

A103S阴离子交换树脂填充的径向流动色谱法(RFC)纯化灵芝多糖,得出样品浓度10 mg/mL、体积100 mL、流速 2 mL/min、洗脱流速 40 mL/min 为最佳纯化条件,脱蛋白率、脱色率和多糖回收率分别为80.35%、

88.52%和 85.06%。特点:与传统化学方法和轴向色谱法相比,RFC可在最短的时间内获得粗多糖,快速、有效处理大量的样品。

1.4 脱盐此外,植物多糖还含有无机盐等小分子杂质,经过脱盐工艺可以取得更严格的精制多糖。目前常用的脱盐法主要有超滤法和透析法。

1.4.1 超滤法超滤膜以膜两侧的压力差为动力,使水及比膜孔

径小的小分子通过超滤膜。王贵金等[22]采用超滤法对盐析后的人参酸性多糖脱盐,分别选择截留分子量为

1、3、5、10、30 kD的不同超滤膜包进行脱盐。洗脱剂为超纯水,超滤进口压力2.5 bar、回流口 1.8 bar,蠕动泵转速为10 r/min,期间不断补充洗脱剂。结果显示1 kD超滤膜效果较好,酸性多糖纯度为94.7%,多糖损失率为4.1%。特点:适用于工业化生产。

1.4.2 透析法透析法使用的半透膜只允许小分子物质通过,可

分离小分子物质和大分子物质。陈达妙等[23]以干物质灰分为指标,采用透析袋流水透析浒苔多糖中的盐,发现透析袋规格越大、透析时间越长,其脱盐效果越 好,但多糖损失率也越高。其透析脱盐最佳条件为

7000 Da、透析时间8h、浒苔多糖溶液浓度6%,灰分可脱除 76.95%。特点:步骤简单、成本低廉、处

理量较大,但易流失样品[22]。

2 分离纯化

2.1 溶剂法

2.1.1 分级沉淀乙醇等有机溶剂会破坏多糖水溶液的氢键,降低多糖在水中的溶解度而析出沉淀。可采用的有机溶剂

有乙醇、甲醇、丙酮。赵书凡等[24]通过热水浸提和不同浓度乙醇分级沉淀苦丁茶冬青多糖,得到乙醇终浓度为 20%、40%、60%和 80%的 4种均一、纯度较高苦丁茶冬青多糖组分。特点:采用不同浓度的有机溶剂会得到不同组分的多糖沉淀。

2.1.2 季铵盐沉淀季铵盐及其氧化物是一类乳化剂,可与酸性多糖形成不溶性沉淀。常用季铵盐有十六烷基三甲基季铵盐的溴化物及其氢氧化物和十六烷基吡啶。郭国赟

等[25]用季铵盐沉淀滑菇多糖,得到酸性亚组分1.273 g、中性亚组分 0.516 g和碱性亚组分 0.301 g。特点:不与中性多糖产生沉淀;常用于酸性多糖的分离,但是当溶液的 pH 值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增

高时,也会与中性多糖形成沉淀[26]。

2.2 柱层析法

2.2.1 凝胶柱层析凝胶颗粒之间空隙很小,多糖这一类的大分子难以进入其空隙,凝胶柱层析可按分子量大小分离物

[27]

质。高航等 选择 DEAE-C 阴离子交换树脂和SepHadex G-25凝胶柱层析,从莲子红衣粗多糖中分离纯化得到纯度分别为 91.16%和 90.24%的中性多糖和酸性多糖。特点:可根据多糖结构大小以不同的流速流出层析柱。

2.2.2 纤维素层析纤维素层析是通过纤维素阴离子交换剂吸附酸性多糖等离子型物质。常用的阴离子交换纤维素有DEAE 和 ECTEOLA。曾婷等[28]取仙茅粗多糖溶于蒸馏水后过DEAE-纤维素柱进一步纯化,并依次用蒸馏水、NaCl溶液梯度洗脱,再进一步经SepHarose CL-6B凝胶柱色谱纯化,获得不同相对分子质量范围,质量分数为91.8%,不含核酸、蛋白质和色素,均一的纯化多糖。特点:酸性强弱不同的酸性多糖可被 pH 相

同而离子强度不同的缓冲液洗脱出来[8]。

2.2.3 大孔树脂柱层析大孔树脂层析通过物理吸附可选择地吸附分离提

纯有机物质。肖代敏等[29]通过对8种树脂的考察表明,

8种不同树脂中D101大孔树脂最适合戴氏虫草多糖的

分离纯化,戴氏虫草多糖的吸附率为(71.85±1.12)%,

解吸附率为(74.37±2.94)%,脱色率为(64.84±

1.89)%。特点:选择性好、可再生、应用范围广。

2.3 膜分离法膜分离技术是通过半透膜两侧的推动力(压力差、化学位差、电位差等),以选择透过性膜作为分离介质,分离不同粒径的分子。

2.3.1 超滤超滤膜除了可脱盐及小分子杂质外,还可进一

步纯化多糖。冯孟鑫等[30]通过超滤优化人参果多糖纯化工艺,确定最佳超滤工艺条件为超滤时间35 min、超滤压力 0.3 MPa、料液质量浓度 2 g/L。该工艺实际膜通量值为 61.571 L/(m2•h),与预测最高理论值

61.523 L/(m2•h)基本相符,得到 77.5%多糖,是未经超滤纯化样品中多糖含量 24.5%的 3.2 倍。特点:过滤简单、易控制、应用广泛。

2.3.2 微滤微滤孔径是一种精密过滤,以压力差为动力,筛

选分离出小分子物质。欧阳小艳等[31]以运行温度30~

45 ℃,流速60 L/min,进出口压力分别为 0.2 MPa、

0.1 MPa 为条件,得到微滤膜纯化后纯度为 83.3%的米糠多糖。特点:有效去除比膜孔大的微粒和微生物,且能耗低、无二次污染、分离效率高。

2.4 色谱分离法

2.4.1 离子交换色谱

不同多糖在一定 pH 条件下所带电荷不同,可根据离子交换色谱法的被分离组分与固定相之间发生

[32]离子交换的能力差来实现分离。罗秋莲等 采用

DEAE-52 阴离子交换柱色谱法以及 Sephadex G-100凝胶柱色谱法对铁皮石斛粗多糖进行分离纯化,得到

4 个不同相对分子质量纯多糖组分,并经分析显示 4种铁皮石斛多糖纯度很高且均一性很好。特点:产物纯度高、污染小,但洗脱体积大,后处理麻烦。

2.4.2 凝胶色谱凝胶色谱是根据凝胶颗粒间隙小的特点,分离大分子物质的分离技术,但此法不适宜粘多糖的分

离[26]。常用葡聚糖凝胶(SepHadex)和琼脂糖凝胶

(SepHarose)。肖健等[33]利用 DEAE琼脂糖凝胶柱纯化龙胆多糖粗品,分别利用蒸馏水和0.5 mol/L NaCl得到 F1 14.1%的中性多糖和 F2 63.4%的酸性多糖。特点:设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很好的分离效果。 3 展望我国植物资源丰富,植物多糖类化合物普遍存在,广泛的药理活性和较低的毒性使其具有深入研究的价值。但由于多糖结构复杂、种类繁多、分离纯化较困难,在除杂质的同时易损失,而限制其后续研究工作。目前大部分植物多糖的除蛋白、色素等杂质及分离纯化为分步进行,进而增加多糖的损失率;且不同的纯化分离条件会分离出不同质量不同类型的精制多糖,这对其生物活性、构效关系及药效研究都会有较大影响。因此,探索出可同时除去杂质又可分离纯化、高效低损失的方法具有一定的研究意义,可推进植物多糖的进一步开发利用。

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(收稿日期:2017-05-26)

(修回日期:2017-06-21;编辑:向宇雁)

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