CJI (Traditional Chinese Medicine)
双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织低氧诱导因子-1α和核因子-κB表达的影响
符超君1,凌艳君2,颜家朝1,赵洪庆1,吕炎1,何文龙1,秦裕辉 1
1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410007;2.湖南省中医药研究院,湖南 长沙 410006
摘要:目的 观察双丹明目胶囊对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠视网膜组织低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、核因子-κB(NF-κB)表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法 SD大鼠尾静脉一次性注射STZ(50 mg/kg)诱导糖尿病模型,眼底荧光血管造影确认DR模型成功。随机分为模型组、中药复方组和阳性药组,同时以正常大鼠为对照。末次给药后,检测大鼠血糖,观察视网膜病变,Western blot 和 RT-PCR 分别检测大鼠视网膜
HIF-1α 和 NF-κB蛋白和基因的表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠血糖显著升高,视网膜微血管增加、
荧光素渗漏明显,HIF-1α、NF-κB蛋白和基因表达均升高;与模型组比较,中药复方组大鼠血糖、视网膜微血
管数量下降,荧光素渗漏面积减少,HIF-1α、NF-κB蛋白和基因表达均降低。结论 双丹明目胶囊可有效抑制DR大鼠新血管生成,保护视网膜组织,其作用可能与下调视网膜HIF-1α、NF-κB 的表达有关。
关键词:糖尿病视网膜病变;双丹明目胶囊;视网膜;低氧诱导因子-1α;核因子-κB;大鼠
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.011
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)06-0044-04
Effects of Shuangdan Mingmu Capsules on Expressions of HIF-1α and NF-κB in Retina of Diabetic Retinopathy Rats
FU Chao-jun1, LING Yan-jun2, YAN Jia-zhao1, ZHAO Hong-qing1, LV Yan1, HE Wen-long1, QIN Yu-hui1
1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China;
2. Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410006, China
Abstract: Objective To observe the effects of Shuangdan Mingmu Capsules on the expressions of HIF-1α and NF-κB; To explore its possible mechanism of treatment. Methods SD rats were injected with STZ (50 mg/kg) into the tail vein to induce diabetes mellitus. After the DR model was confirmed by fundus fluorescein angiography, the rats were randomly divided into model group, Shuangdan Mingmu Capsules group and positive medicine group, and normal rats were set as control group. After the last administration, the blood glucose level and retinopathy in rats were measured. The protein and gene expression of HIF-1α and NF-κB in the retina were detected by Western blot and RT-PCR respectively. Results Compared with control group, the blood glucose in the model group was significantly increased; the retinal capillaries increased; the leakage of fluorescein was obvious; the protein and gene expressions of HIF-1α, NF-κB were significantly increased. After administration of Shuangdan Mingmu Capsules, the model rats decreased blood glucose; retinal microvascular volume decreased; fluorescein leakage area was significantly reduced; protein and gene expressions of HIF-1α and NF-κB were decreased. Conclusion Shuangdan Mingmu Capsules can effectively inhibit the neovascularization of DR rats and protect the retina, which may be related to the down-regulation of the expressions of HIF-1α and NF-κB.
Keywords: diabetic retinopathy; Shuangdan Mingmu Capsules; retina; HIF-1α; NF-κB; rats
反应较大。双丹明目胶囊主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的 DR,临床应用疗效较好[2-3]。本课题组前期研究表明,双丹明目胶囊能降低DR大鼠血糖值及血浆黏度,缓解视网膜各层结构水肿、坏死情况,降低视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth
factor,VEGF)表达,保护视网膜组织[4-5],但其确切机制尚不清楚。本研究在前期基础上,进一步以VEGF
上游因子低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和视网膜上核因子-κB(NF-κB)为切入点,探讨双丹明目胶囊治疗DR的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF 级雄性SD 大鼠 48只,体质量 220~240 g,湖南斯莱克景达实验动物公司,动物许可证号SCXK
(湘)2013-0004。饲养于湖南省中医药研究院 SPF级实验动物中心,适应性喂养5 d,自由摄食饮水。
1.2 药物双丹明目胶囊(女贞子、墨旱莲、三七、山萸肉、山药、牡丹皮、茯苓、红土茯苓、牛膝、丹参、泽泻),饮片购于湖南上药九旺医药有限公司;羟苯磺酸钙胶囊,奥地利依比威药品有限公司,批号170603。
1.3 主要试剂与仪器
兔抗鼠 HIF-1α、NF-κB 一抗(美国 R&D),STZ (美国Sigma),血糖测量仪、试纸(美国 Johnson), RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、Trizol(美国 Thermo),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德), SYBR MasterMix、反转录试剂盒(日本 Takara),10%荧光素钠注射液(广州白云山)。视网膜成像系统(加拿大 Optoprobe),CF-600 眼底照相机(日本佳能),
5417R 低温高速离心机(德国 Eppendorf),电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统(美国 Bio-Rad),超微量核酸蛋白测定仪(英国 BioDrop),Lightcycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR 仪(瑞士 Roche)。
1.4 造模与给药
48 只 SD大鼠先分为对照组(10只)和糖尿病组
(38只)。糖尿病组给予高脂饲料灌胃14 d后,采用一次性尾静脉注射 STZ(50 mg/kg)建立糖尿病模型,于 STZ 注射 72 h后测定所有大鼠空腹血糖。根据血
糖测定结果,选取血糖≥16.7 mmol/L 大鼠作为糖尿病模型大鼠。继续饲养1周后,对所有糖尿病大鼠进行眼底荧光血管造影,选取视网膜发生病变的大鼠视为 DR 模型成功(28只)。然后,选取 27 只 DR大鼠随机分为模型组、中药复方组、阳性药组,每组9 只。中药复方组给予双丹明目胶囊药液,药物浓度为临床
等效剂量(5.6 g/kg),阳性药组给予羟苯磺酸钙胶囊药液,等效给药浓度为5.8 mg/kg,正常组与模型组均给予等量蒸馏水,给药体积为10 mL/kg,连续 30 d。末次给药后,所有大鼠进行血糖测定,并选取部分大鼠再次进行眼底荧光血管造影。检测完成后麻醉大
鼠,取右眼视网膜组织,4%多聚甲醛溶液保存,用于病理检测,左眼视网膜组织置于液氮中冻存待用。
1.5 空腹血糖测定测定前所有大鼠禁食 6 h,采用剪尾取血法剪取大鼠尾根部动脉血,血糖仪测定各组大鼠空腹血糖。
1.6 眼底荧光血管造影
大鼠腹腔注射 10%荧光素钠(0.5 mL/kg),用托吡卡胺滴眼液散瞳后,将大鼠右眼置于眼底血管造影仪前,分开大鼠右眼眼睑确保瞳孔充分暴露,调整仪器焦距后收集图像,判断大鼠眼部有无病变。
1.7 Western blot 实验取冻存的视网膜组织,加入一定量RIPA 裂解液,冰上匀浆后于4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min,取上清液制备组织蛋白提取液,BCA试剂盒法测定组织蛋白含量。按照 Western blot实验步骤分别检测大鼠视网膜中 HIF-1α、NF-κB 的蛋白表达量,根据目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值计算蛋白相对表达量。
1.8 RT-PCR 实验取冻存视网膜组织,加一定量 Trizol 试剂提取组织总 RNA,检测含量合格后按反转录试剂盒说明将RNA反转录成 cDNA,PCR 反应扩增 HIF-1α、NF-κB基因产物,以 β-actin 基因为内参,引物由深圳华大基
因公司合成。HIF-1α(143 bp)引物序列:上游5'-AAG
TCTAGGGATGCAGCACG-3';下游 5'-AGATGGGAG
CTCACGTTGTG-3';NF-κB(148 bp)引物序列:上游5'-TGTCACTCAGGCTCTTCACCCA-3';下游5'-TA
GGCTCCCGTATGCCCTCACC-3';β-actin(140 bp)引物序列:上游 5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3';下游 5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。
1.9 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料用x±s 表示,组间比较用 Dunnett's 检验。P<0.05 表示差
—
异有统计学意义。
2 结果2.1 双丹明目胶囊对模型大鼠空腹血糖的影响与对照组比较,模型组大鼠空腹血糖显著升
高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药复方组大鼠空腹血糖显著降低,差异有统计学意
义(P<0.05)。结果见图 1。
注:与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05
图1 各组大鼠空腹血糖比较(x±s,每组— 9 只)
2.2双丹明目胶囊对模型大鼠眼底荧光血管造影的影响
对照组大鼠视网膜血管呈放射状均匀分布,微细血管少,无荧光素渗漏;模型大鼠视网膜微细血管明显增加,部分血管呈迂曲状,可观察到明显的荧光素渗漏,且局部渗漏区域连接成网状;中药复方组大鼠视网膜微细血管数量下降,荧光素渗漏面积显著减少,且基本只发生于微血管末梢,局部呈点状排列。结果见图2。 图2 各组大鼠右眼视网膜眼底荧光血管造影(×40) 2.3 双丹明目胶囊对模型大鼠视网膜低氧诱导因
子-1α、核因子-κB 蛋白表达的影响与对照组比较,模型组大鼠视网膜HIF-1α、NF-κB
蛋白表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,中药复方组和阳性药组大鼠视网膜 HIF-1α、NF-κB 蛋白
表达均显著降低(P<0.05,P<0.01)。结果见图 3。
2.4 双丹明目胶囊对模型大鼠视网膜低氧诱导因
子-1α、核因子-κB 基因表达的影响与对照组比较,模型组大鼠视网膜 HIF-1α、NF-κB 基因表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,中药复方组和阳性药组模型大鼠视网膜组织
HIF-1α、NF-κB 基因表达均显著降低(P<0.05,P<
0.01)。结果见图 4。 3 讨论
DR 临床多以视网膜微血管生成、出血、水肿、渗出等为主要特征[6]。DR 中医病机可理解为肝肾阴虚、瘀血阻络,其中阴虚为本、肾虚为根、血瘀为标。治疗以滋阴、补肾、活血为基本法则,双丹明目胶囊是基于此理法并结合多年临床经验成方,疗效显著。
血糖作为糖尿病的核心指标,与DR发生率密切相关,DR 多发生于长时间未能有效控制血糖[7]。然而,治疗DR的临床首选药物导升明无降糖效果,中药立足于整体,能多环节、多途径作用于疾病,改善患者依从性,增加用药安全。本研究发现,双丹明目胶囊能有效降低DR大鼠血糖,抑制微血管生成,改善微血管渗漏,进而保护视网膜组织。
血管通透性增加以及新血管生成是DR发生的重
要原因,血管生成刺激因子和血管生成抑制因子之间
平衡的打破是微血管生成的关键机制[8]。研究表明,在缺血缺氧等病理状态下,血管生成的平衡调节极易被打破,而在视网膜病变研究中发现缺氧是刺激VEGF 分泌增加的重要因素[9]。HIF-1 是机体低氧和缺氧的基因表达的主要调节因子,由α和 β两个亚基组成,其活性主要通过α 亚基的调节来实现。HIF-1α负责调控缺氧引起的多种细胞适应性反应,如血管新生、新陈代谢以及细胞凋亡等,能直接增强VEGF 的
转录活性,使其表达增加而诱导血管生成[10-11]。此外,缺氧过程又能导致 NF-κB 活化,从细胞浆向细胞核转移,并启动和促进内皮细胞分泌细胞黏附分子和其他促血管生成的细胞因子(如 VEGF),增强多形核白
细胞与内皮细胞间的黏附,促进新生血管形成[12]。本研究结果显示,DR大鼠视网膜 HIF-1α、NF-κB 蛋白和基因表达均明显增加,与文献报道一致;在给予双丹明目胶囊干预后,上述趋势得到有效逆转,说明该药物可降低 HIF-1α、NF-κB 的表达而抑制新血管生成,保护视网膜组织。
综上,本研究显示双丹明目胶囊是通过降低 DR大鼠视网膜 HIF-1α、NF-κB 表达而发挥抑制新血管生成作用,阐明了双丹明目胶囊保护视网膜组织、治疗DR 的部分机制,但其更深入的疗效机制仍有待进一步研究。
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(收稿日期:2018-01-25)
(修回日期:2018-02-06;编辑:华强)