山茱萸环烯醚萜苷对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及脑组织病理变化的影响

孟敏，杨翠翠，张丽，李雅莉，张兰，李林首都医科大学宣武医院药学部，北京市神经药物工程技术研究中心，神经变性病教育部重点实验室，北京 100053

摘要：目的 观察山茱萸环烯醚萜苷对血管性痴呆（VD）大鼠学习记忆能力和脑组织病理变化的影响，探讨其相关机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组和山茱萸环烯醚萜苷低、中、高剂量

组。采用永久性双侧颈总动脉结扎（2VO）手术造模，术后6h开始灌胃给药，每日1次，共3 个月。Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，物体识别实验评价大鼠识别记忆能力。免疫组化染色检测脑组织存活神经元和胆碱乙酰基转移酶（ChAT）表达。结果 永久性2VO 术后3个月，模型组大鼠逃避潜伏期延长，识别指数降低，海马和大脑皮层NeuN 阳性神经元存活数减少，ChAT表达降低；与模型组比较，山茱萸环烯醚萜苷各剂量组大鼠逃避潜伏期缩短，识别指数升高，海马和大脑皮层NeuN阳性神经元存活数增多，海马ChAT表达升高。结论 山茱萸环烯醚萜苷通过保护神经元和促进ChAT表达从而改善VD大鼠的认知功能障碍。

关键词：山茱萸环烯醚萜苷；双侧颈总动脉结扎；血管性痴呆；认知功能障碍；神经元存活；胆碱乙酰基转移酶；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)06-0056-05

Effects of Cornel Iridoid Glycoside on Learning-memory Ability and Brain Pathological Changes in Vascular Dementia Rats

MENG Min, YANG Cui-cui, ZHANG Li, LI Ya-li, ZHANG Lan, LI Lin

Department of Pharmacy, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing Engineering Research Center for Nervous System Drugs, Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education, Beijing 100053, China

Abstract: Objective To investigate the effects of cornel iridoid glycoside (CIG) on the learning-memory ability and pathological changes in the brain of vascular dementia (VD) rats; To discuss relevant mechanism of action. Methods SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group, positive medicine group, CIG groups low-, medium- and high-dose groups. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion (2VO) in rats. Drugs were intragastrically administered 6 h after surgery and then once a day for 3 months. Morris water maze test was used to detect spatial learning-memory ability, and recognition memory was measured by the object recognition test. Immunohistochemical staining was used to detect the neuronal survival and the expression of choline acetyltransferase (ChAT) in the brain. Results Three months after permanent 2VO operation, the model rats showed a longer escape latency in Morris water maze, a lower discrimination index in the object recognition test, and a decrease in NeuN positive neuronal survival and ChAT expression in the hippocampus and cerebral cortex. Compared with the model group, intragastric administration of CIG for 3 months shortened the escape latency in Morris water maze, elevated the discrimination index in the object recognition test, and increased the NeuN positive neuronal survival in the hippocampus and cerebral cortex and ChAT expression of 2VO rats. Conclusion CIG can improve the cognitive impairment of VD model rats through protecting neurons and promoting ChAT expression.

Keywords: corneliridoid glycoside; bilateral common carotid artery ligation; vascular dementia; cognitive impairment; neuronal survival; choline acetyltransferase; rats

基金项目：国家自然科学基金（81673406、81473373）；北京市自然科学基金（7164315）

通讯作者：李林，E-mail：linlixw@126.com

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由缺血性卒中、出血性卒中及造成记忆、认知和行为等脑区低灌注脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。大鼠永久性双侧颈总动脉结扎（ bilateral common carotid artery ligation，2VO）致慢性脑血流灌注不足模型能很好地模拟人VD中认知功能障碍和神经元死亡等病理变化。山茱萸环烯醚萜苷（cornel iridoid glycoside，CIG）是从传统补肾中药山萸肉中提取的有效组分。本课题组以往研究表明，CIG能改善局灶性脑缺血大鼠模型的神经功能缺损，抑制脑组织炎症

和神经元凋亡，促进神经发生和血管新生[1-2]；并可改善穹窿-海马伞切断模型大鼠学习记忆功能，增高

脑组织神经营养因子含量和神经元存活[3]。本实验采用永久性 2VO 大鼠模型模拟 VD，观察 CIG 对该模型学习记忆功能和脑组织神经元存活的影响。1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠 90只，体质量 260～280 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号

SCXK（京）2012-0001。饲养于 SPF级屏障环境，室温 20～25 ℃，相对湿度 50%～70%，12 h光照，自由摄食饮水。

1.2 药物CIG，本研究室从山萸肉中提取，纯度70%；尼莫地平，正大青春宝药业有限公司，批号20151126。

1.3 主要试剂与仪器

抗 NeuN 抗体，Abcam 公司（ab177487）；抗胆

碱乙酰基转移酶（ChAT）抗体，博士德公司（BA0596）；生物素标记的抗兔IgG，中杉金桥公司；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，Vector Laboratories 公司； DAB 显色试剂盒，西雅金桥公司。Morris 水迷宫，中国医学科学院药物研究所；冰冻切片机，Thermo公司；生物显微镜，Olympus 公司。

1.4 造模

待大鼠体质量达到300 g，进行永久性2VO手术。

10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，行颈正中切口，游离双侧颈总动脉，结扎，涂抹青霉素粉末并缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉不结扎。

1.5 分组及给药

实验大鼠随机分为假手术组（17只）、模型组（14

只）、阳性药组（16 mg/kg，14 只）和 CIG 低剂量组

（30 mg/kg，15 只）、CIG 中剂量组（60 mg/kg，16只）、CIG 高剂量组（120 mg/kg，14 只），各给药组造模术后6h开始给予相应药物灌胃，假手术组和模 型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积1 mL/100 g，每日 1 次，共 3个月。实验过程动物死亡假手术组6只、模型组2 只、CIG 低剂量组2 只、CIG 中剂量组4只、CIG 高剂量组1只和阳性药组2只。除假手术组1只

因牙齿过长戳破口腔死亡，1 只为同笼互相打斗致死外，其余动物均为麻醉死亡或手术后遗症（肠梗阻、术后出血）死亡。

1.6 Morris 水迷宫实验

水迷宫直径200 cm，水深30 cm，水温（20±3）℃，水面平均分成4个象限。根据 Vorhees C V 等[4]方法，每日每只大鼠训练2 次，120 s/次，共 5 d，平台放置在任意象限，平台位于水下1.5 cm，选取平台邻象限和对象限作为入水点，记录大鼠在120 s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。

1.7 物体识别实验将大鼠旷场箱隔离成2个等大的箱子，长80 cm、宽 40 cm、高 40 cm，根据文献[5]方法，实验分3部分，适应期：第1日，将大鼠放入箱中，箱中不放任

何物体，10 min/只；熟悉期：第 2日，在箱中放入2个相同物体（A，A’），记录大鼠对 2 个物体的关注时间（以鼠嘴的方向对着物体，凑近约2 cm 范围内计时，鼠趴在物体上或者只在物体附近走动则不能计

时[6]）；测试期：第 3日，将其中一个物体换成新物体，记录大鼠对新、旧物体的关注时间，计算识别指数。识别指数为大鼠关注新旧物体时间差与关注新旧物体时间和的比值。每只大鼠实验结束后，用消毒液清洁盒子和物品，消除气味。

1.8 取材

每组取4 只大鼠，10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后开胸，剪开心包膜，暴露心脏和主动脉弓。用钝头针头插入左心室至主动脉弓，灌注

0.9%氯化钠注射液 200 mL，经体循环和肺循环冲洗全身血管，待右心耳流出液无色透明时，灌注 4%多聚甲醛 200 mL，至大鼠全身僵硬。灌注后2 h，开颅取脑，固定，冰冻，取冠状位，连续切片（厚40 μm）。

1.9 免疫组化检测

每组取4只大鼠，每只取3张脑片，所选切片于

3%H2O2室温孵育 30 min，PBST 洗 3 次×5 min，加入10%羊血清，室温孵育 30 min，倾去。滴加抗 NeuN

抗体（1∶200）或抗 ChAT 抗体（1∶200），4 ℃过夜；PBST 洗 3 次，每次 5 min。加生物素标记抗兔 IgG

工作液，37 ℃孵育1 h，PBST 洗 3 次×5 min。加适

量过氧化物酶标记的链霉卵白素，37 ℃孵育 1 h， PBST 洗 3 次×5 min。DAB显色，自来水终止显色，

晾干后，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.10 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，组间比较用方差分析。P＜0.05表示差异有—

统计学意义。

2 结果2.1 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠学习记忆能力的影响

2.1.1 Morris 水迷宫实验结果随训练时间增加，逃避潜伏期呈逐渐缩短趋势；第 4、5 日，模型组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显

延长（P＜0.05）；CIG各剂量组大鼠逃避潜伏期较模

型组明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表1。

2.2 山茱萸环烯醚萜苷对模型大鼠脑组织神经元存活的影响

模型组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数

较假手术组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）； CIG各剂量组大鼠大脑皮层和海马NeuN阳性神经元数较模型组明显增加，差异有统计学意义（ P＜

0.05）。结果见表 3、图 1和图2。