Box-Behnken效应面法优化丹皮酚纳米结构脂质载体温敏型原位凝胶处方及其体外释放性能考察

2018-06-15 -

龙凯花1，黄昕玥1，王春柳2，穆珺3，李晔 2

1.西安培华学院，陕西西安 710125；2.陕西省中医药研究院，陕西西安 710003；

3.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046

摘要：目的采用 Box-Behnken 效应面法优化丹皮酚纳米结构脂质载体（NLC）温度敏感型原位凝胶的处方，并对其体外释放性能进行考察，为经皮给药制剂的研究提供参考。方法以泊洛沙姆 407 和泊洛沙姆

188质量分数为考察因素，胶凝温度为考察指标，通过二项式模型及多元线性回归模型拟合并建立胶凝温度与

2个考察因素之间的数学关系，采用 Box-Behnken 效应面法，对丹皮酚NLC温敏型原位凝胶的处方进行优化，并考察该制剂的体外释药特性。结果胶凝温度与2个考察因素之间存在可信定量关系，且二项式模型较多元线性模型置信度高。丹皮酚NLC温敏型原位凝胶的最佳处方为22.90%泊洛沙姆 407 和 3.34%泊洛沙姆 188，

胶凝温度为（33.4±0.1）℃，24 h内丹皮酚NLC原位凝胶的累积释放量为51.19%。结论该方法适用于丹皮酚 NLC温敏型原位凝胶的处方优化，建立的数学模型预测性良好，优选的处方可为丹皮酚经皮给药制剂的开发提供参考。关键词：温敏型原位凝胶；丹皮酚；纳米结构脂质载体；星点设计-效应面法；经皮给药

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.018

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2018)06-0073-04

Optimization of Paeonol NLC Thermosensitive Gel Formulation by Box-Behnken Response Surface Methodology

LONG Kai-hua1, HUANG Xin-yue1, WANG Chun-liu2, MU Jun3, LI Ye2

1. Xi'an Peihua University, Xi'an 710125, China; 2. Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Xi'an 710003,

China; 3. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

Abstrsct: Objective To optimize the formulation of paeonol nanostructured lipid carrier (NLC) thermosensitive in situ gel through Box-Behnken response surface method; To investigate its release properties in vitro to provide references for the study of transdermal drug delivery system. Methods Taking mass fraction of poloxamer 407 and poloxamer 188 as the factors, the gelling temperature as the index, the mathematical relationship between the gelling temperature and two factors was established by binomial model and multivariate linear regression model. The Box-Behnken response surface method was used to optimize the formulation of paeonol NLC thermosensitive in situ gel, and the in vitro release characteristics of the preparation was investigated. Results There was a credible quantitative relationship between the gelling temperature and the 2 factors, and the binomial model was more reliable than the multivariate linear model. The best prescriptions of paeonol NLC thermosensitive in situ gel were 22.90% poloxamer 407 and 3.34% poloxamer 188; gelling temperature was (33.4±0.1)℃, and the cumulative release amount of paeonol in situ gel in 24 h was 51.19%. Conclusion This method is suitable for the formulation optimization of paeonol NLC thermosensitive in-situ gel, and the established mathematical model has good predictability. The optimized formulation can provide references for the development of paeonol transdermal preparation.

Keywords: in situ thermosensitive gel; paeonol; nanostructured lipid carrier; central composite design - response surface method; transdermal drug delivery

基金项目：陕西省创新药物研究中心（2017YWZX-02）

通讯作者：李晔，E-mail：liyelsj@163.com

丹皮酚又称牡丹酚，主要是从萝摩科植物徐长卿Cynanchum paniculatum（Bunge）Kitagawa 的干燥根或全草和毛茛科芍药属植物牡丹 Paeonia fruticosa Andr、芍药 P.lacti flora Pall.的根皮中提取分离出来的活性成分。大量研究表明，丹皮酚具有良好的抗炎、

抗过敏及抗感染作用[1-3]，但由于丹皮酚的脂溶性极强，生物利用度极低，具有易挥发、易氧化、生物半衰期短等缺点，影响其制剂的稳定性和生物利用

度[4-6]。纳米给药系统具有增溶难溶性药物、提高药物生物利用度的特点，能够明显改善药物及制剂的突释效应，延长药物作用时间，减少用药次数，提高患者依从性。温度敏感型原位凝胶剂作为近年来新型的

外用制剂，具有易于涂抹、生物相容性好等优点[7]，局部给药后易于吸收、不污染衣物、稳定性好。

本研究以中药单体丹皮酚为模型药物，将纳米结构脂质载体与温度敏感型原位凝胶材料结合，以泊洛沙姆 407（P407）和泊洛沙姆 188（P188）为基质，制备丹皮酚纳米结构脂质载体（NLC）温敏型原位凝胶，用于经皮给药，采用星点设计-效应面法优化凝胶处方，使其在室温时为溶液，在炎症部位涂抹后能迅速发生相变形成凝胶，从而延长丹皮酚在皮肤表面的滞留时间，增加药物作用时间，为经皮给药制剂的开发提供参考。

1 仪器与试药1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）， BP211D 型十万分之一分析天平（德国赛多利斯天平

有限公司），Synergy 型超纯水系统（美国 Millipore公司），HJ-6 型多头磁力加热搅拌器（常州国华电器

有限公司），RC806D型溶出试验仪（天大天发科技有

限公司）。

透析袋（截留相对分子质量8 kDa，国药集团化学试剂有限公司），丹皮酚对照品（中国食品药品检定研究院，纯度 98%，批号 708-9003），丹皮酚原料

药（西安天一生物技术有限公司，质量分数≥99%），硬脂酸（天津市红岩试剂厂，批号 2010041228B），肉豆蔻异丙酯（IPM，国药集团化学试剂有限公司，批号 F20100420），辛酸/癸酸乙二醇甘油酯（Labrasol，法国嘉法师公司，批号 201006），二乙二醇单乙基醚（Transcutol HP，法国嘉法师公司），P407（美国 Sigma

公司），P188（德国 BASF公司），甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果2.1 丹皮酚纳米结构脂质载体温敏型原位凝胶制备采用微乳法制备丹皮酚 NLC[8] ， 3%硬脂酸和

3%IPM（Km＝1∶1）为混合油相，18%Labrasol 和

6%Transtol HP为混合乳化剂（Km＝3∶1），5%丹皮酚，余量用超纯水补齐 100%制成初乳液。将此处方于0 ℃条件下分散于冰水中，得到淡蓝色乳光的NLC

分散液。采用冷溶法制备丹皮酚温敏型原位凝胶[9]。将制备的丹皮酚NLC 置于冰箱中，4 ℃冷藏1 h，在磁力搅拌下缓慢加入P407 和P188，继续搅拌使其分

散均匀，放入冰箱，4 ℃保存大于24 h，使泊洛沙姆充分溶胀，最终形成淡蓝色半透明的丹皮酚 NLC 温敏型原位凝胶溶液。

2.2 胶凝温度的测定取制备好的纳米粒凝胶溶液2 mL于西林瓶中，放入20 ℃水浴锅，西林瓶内液面低于水浴液面1 cm，缓慢升温。每升高 0.1 ℃即倾斜西林瓶45°，观察液体流动情况，不再流动时的温度即为凝胶的相转变温

度[10]。

2.3处方优化

2.3.1试验设计在单因素试验基础上，以胶凝温度为考察指标，选取 P407 和 P188 质量分数为考察因素，P407 的取值范围为 18%～24%，P188 的取值范围为0～10%。根据 Box-Behnken 设计原理，胶凝温度为因变量，每个因素5个水平，分别为±α、±1和 0（α＝1.414），试验设计及结果见表1。 2.3.2模型拟合

采用 Design-Expert8.06 软件分别对因变量与各自变量的关系进行多元线性回归和二项式方程拟合，分别得多元线性方程 Y＝88.289 71－2.680 71X1＋

1.308 72X2（r＝0.877 9，P＜0.000 1）及二项式方程Y＝

181.156 25－11.399 04X1＋1.195 72X2＋0.103 33X1X2＋

0.195 28X12－0.205 70X22（r＝0.998 0，P＜0.000 1），说明采用二项式方程拟合的效果较好。对二项式方程拟合模型进行方差分析，结果见表2。

2.3.3 效应面优化与预测

应用 Design-Expert8.06 软件绘制各自变量对因变量的三维效应面和二维等高线图，见图 1。结果显示，当 P188 质量分数不变、P407质量分数增大时，丹皮酚 NLC 温敏型原位凝胶溶液的胶凝温度呈下降趋势；当 P407 质量分数不变、P188质量分数增大时，胶凝温度先升高后趋于平稳，与单因素试验结果一致。据文献报道，温敏凝胶在体外的胶凝温度均在

25～27 ℃之间[11]，但考虑到夏季高温，凝胶在室温下即会发生相转变，需冷藏储存，不便于患者用药，因此确定胶凝温度在 32～34 ℃，得处方 1（X1＝

22.85%，X2＝3.37%）、处方 2（X1＝22.90%，X2＝

3.34%）、处方 3（X1＝21.39%，X2＝1.97%）、处方 4

（X1＝23.02%，X2＝3.76%）、处方 5（X1＝23.06%，

X2＝4.44%）。 2.4工艺验证

按上述 5 个处方制备丹皮酚 NLC 原位凝胶，平行 3份，测定胶凝温度，与预测值比较，结果见表3。可见，各处方的实测值与预测值差异较小。其中，处方 2的实测值与预测值偏差最小，故选择处方2进行后续研究。

2.5体外释放性能考察

2.5.1色谱条件

采用 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱

（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相为甲醇-水（70∶

30），检测波长为 274 nm，进样量为 10 µL，流速为

1.0 mL/min，柱温 30 ℃。

2.5.2 标准曲线绘制准确称取丹皮酚对照品 10.71 mg 置于 50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，得 214.20 µg/mL 贮备液。以透析介质为溶剂，配制浓度分别为 11.90、23.80、

35.70、59.50、71.40、107.10 µg/mL 的丹皮酚对照品

溶液，按“2.5.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程 Y ＝ 40.255X＋

16.950，r＝0.999 8，线性范围 11.90～107.10 µg/mL。

2.5.3 精密度考察精密吸取高、中、低质量浓度的丹皮酚对照品溶

液适量，按“2.5.1”项下色谱条件连续进样6次，计算峰面积的RSD 分别为 0.5%、0.4%、0.2%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 加样回收率试验取适量空白凝胶，分别精密加入高、中、低浓度

（107.10、59.50、11.90 µg/mL）的丹皮酚对照品溶液

1 mL，用相应介质稀释并混匀，经0.45 µm微孔滤膜

过滤，按“2.5.1”项下色谱条件测定，计算回收率分别为0.98%、0.96%、0.97%，RSD分别为0.98%、0.96%、

0.97%，结果见表 4。

2.5.5 药物体外释放试验分别精密量取丹皮酚原料药、丹皮酚 NLC 和丹皮酚 NLC温敏型原位凝胶各5 mL，置于透析袋中，

将透析袋置于水浴温度为（34±0.5）℃的生理盐水

500 mL中，转速 100 r/min 磁力搅拌，每隔一定时间取样 2 mL，并补充等量同温度生理盐水[12]。按“2.5.1”项下色谱条件测定丹皮酚含量，计算累积释放度，见图2。结果表明，与原料药比较，丹皮酚NLC 及丹皮酚 NLC 温敏型原位凝胶的体外释放均较缓慢，具有明显的缓释效果，而丹皮酚 NLC 温敏型原位凝胶的

释放时间延长较为明显，24 h 内丹皮酚 NLC 及丹皮酚 NLC温敏型原位凝胶的累积释放度分别为59.18%和 51.19%。 3 讨论为了延长丹皮酚在炎症部位的作用时间，本试验采用 NLC 作为载体材料，制备丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶。原位凝胶能够以液体状态自由加载各种性质的药物，以液体状态给药后，在用药部位立即发生相转变，可有效延长药物在用药部位的滞留时间，具有良好的顺应性和缓控释能力，同时可起到储

存药物、防止药物受环境影响等作用[13-14]。经处方优化制备的丹皮酚 NLC 纳米粒粒径约为

78 nm，较小的粒径和 P407的表面活性剂对促进药物的透皮性能具有协同作用，增加了 P407 凝胶黏度，延长了凝胶在表皮的黏附时间，并可促进药物的累积

透皮率[15]。

本研究制备的丹皮酚 NLC 温敏型原位凝胶结合了 NLC 与原位凝胶的优点，在增加药物溶解度的同时，在体表温度下能够发生相变形成凝胶，延长药物与炎症部位的作用时间，减少药物流失，增加药物的吸收。初步体外释药试验结果表明，丹皮酚NLC原位凝胶缓释效果良好，可进一步延长丹皮酚的释放时间，后续试验将对其体内外透皮吸收情况进行研究。

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