肝豆灵片中黄连有效成分HPLC定性定量分析

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

陈莉,王盛,秦秀娟,孟楣安徽中医药大学第一附属医院,国家中医药管理局中药制剂三级实验室,安徽 合肥 230031摘要:目的 优化黄连有效成分的 HPLC 条件,建立肝豆灵片中黄连相关成分的定性定量分析方法。方法 采用 HPLC对肝豆灵片中黄连的有效成分进行定性定量分析。流动相为乙腈∶0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶

液=50∶50(每 100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节pH 值为 4.0),流速为 1.0 mL/min,检测波长为 345 nm。结果 可以鉴别出黄连中表小檗碱、黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀4个成分,且阴性对照无干扰;盐酸小檗碱对照品进样量在 0.058~0.580 μg、盐酸巴马汀对照品进样量在 0.030~0.300 μg 范围内与吸收度峰面积值呈良好的线性关系,平均回收率分别为 98.18%、99.99%,RSD 分别为 2.40%、1.70%。结论 本研究建立的方法操作简便、准确、重复性好,可用于肝豆灵片的质量控制。关键词:肝豆灵片;黄连有效成分;高效液相色谱法;定性分析;定量分析

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.021

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)06-0087-03

Qualitative and Quantitative Analysis of Active Components of Copditis Rhizoma in Gandouling Pills by HPLC

CHEN Li, WANG Sheng, QIN Xiu-juan, MENG Mei

The First Affiliated Hospital of Anhui College of TCM, State Administration of National Chinese Drugs Medicament

Laboratory of Grade 3, Hefei 230031, China

Abstract: Objective To optimize the HPLC conditions for active components of Coptidis Rhizoma; To establish qualitative and quantitative analysis method for related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. Methods HPLC was used for the qualitative and quantitative analysis of related components of Coptidis Rhizoma in Gandouling Pills. With acetonitrile: 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution = 50:50 (per 100 mL was added 0.4 g sodium dodecyl sulfate, and then adjusted pH to 4.0 with phosphoric acid) as mobile phase, the flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 345 nm. Results Four components of Coptidis Rhizoma can be identified, including berberine, coptisine, berberine hydrochloride and palmatine chloride, and the negative control had no disturbance. Berberine hydrochloride reference and the absorbance peak area value showed a good linear relationship within 0.058–0.580 μg sample volume, and palmatine chloride reference was the same within 0.030–0.300 μg sample volume. The average recovery was 98.18% and 99.99%, and RSD was 2.40% and 1.70%, respectively. Conclusion The method is simple, accurate and with good repeatability, which can be applied effectively to the quality control of Gandouling Pills.

Keywords: Gandouling Pills; active components of Coptidis Rhizoma; HPLC; qualitative analysis; quantitative analysis

作为国家重大疑难病防治中心和国家中医药管理局肝豆状核变性协作组组长单位,安徽中医药大学第一附属医院脑病中心专家根据长期临床实践,认为痰瘀互结贯穿于该病始终,提出以化痰祛瘀为治法,总结出具有祛痰化瘀、软坚散结功效的医院制剂肝豆灵片(皖药制字 Z20050071),该制剂在临床使用 20 余年,在改善肝豆状核变性患者神经功能方面取得良好疗效。为保证该制剂临床使用的安全性和疗效的稳定性,本研究建立方中臣药黄连主要有效成分的HPLC测定方法,以有效控制本品质量。1 仪器与试药

Agilent1260 高效液相色谱仪(DAD紫外检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置和自动进样器), Analytical C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),超

声波清洗器(SK3200H,天津天有利科技有限公司),电子天平(Sartorius BP211D)。

肝豆灵片(批号 20170609、20170310、20161024、

20160703、20160318、20151123),安徽省中医院制剂室;小檗碱对照品(批号 110713-201212),中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱纯,屈臣蒸馏水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液精密称取盐酸小檗碱和盐酸巴马汀对照品适量,加甲醇制成每毫升含盐酸小檗碱0.029 mg、盐酸巴马汀 0.060 mg的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取本品粉末 0.1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,

精密加入盐酸-甲醇(1∶100)50 mL,称定质量,超声处理(功率 250 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,

再称定质量,用盐酸-甲醇(1∶100)补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.1.3 阴性对照溶液取缺黄连的阴性制剂,按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

采用Analytical C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),

流动相为乙腈∶0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液=50∶50 (每 100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调pH 值为 4.0),检测波长 345 nm,柱温 30 ℃,流

1.0 mL/min。吸取供试品溶液 10 μL,注入液相色仪测定。理论塔板数按小檗碱峰计算 n=12 442,分离度 R=3.18,拖尾因子 T=0.99,均符合药典规定。

2.3 黄连相关成分定性分析分别吸取供试品溶液、对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪中,测定,结果供试品色谱中依次出现

4 个含量较高的色谱峰(保留时间分别为 14.119、

1.639、18.767、20.888 min)。色谱图见图 1。以小檗

碱为参照,4 个色谱峰的相对保留时间(见表 1)与

2015年版《中华人民共和国药典》黄连项下含量测定项中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱保留时间规

定值[1]的误差均小于 5%,符合要求。因此,可以初步验证供试品色谱呈现的4个色谱峰分别为黄连相关

成分表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱。1、2号峰保留时间分别与盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品溶液一致,且阴性对照无干扰,从而进一步验证1、2、3、

4号峰分别为小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱。

2.4盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量测定

2.4.1标准曲线的绘制

分别精密吸取0.029 mg/mL盐酸小檗碱对照品溶液 2、4、6、8、16、20 μL,0.006 mg/mL 盐酸巴马汀对照品溶液 0.5、1、2、3、4、5 μL,依次注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定,分别以盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的进样量为横坐标,相应的峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线,计算盐酸小檗碱和盐

酸巴马汀的线性回归方程分别为:Y=4139.522 4X+

2.032 2,r=0.999 98;Y=4844.996 8X+7.030 8,r=

0.999 96。结果盐酸小檗碱对照品进样量在 0.058~

0.580 μg、盐酸巴马汀对照品进样量在 0.030~0.300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验精密吸取供试品溶液10 μL,连续进样 6次,测定峰面积积分值,结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD

分别为 0.33%、1.10%,表明本法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验取供试品溶液,于室温放置 0、2、4、6、8、10 h进样测定,结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀 RSD 分别为 0.23%、1.14%,表明供试品溶液中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀在10 h内稳定。

2.4.4 重复性试验

取样品(批号 20140307)6 份,按含量测定项下方法制备并测定,结果盐酸小檗碱、盐酸巴马汀RSD分别为 2.36%、1.48%,表明本法重复性良好。

2.4.5 样品的测定与含量限度的确定取样品,每批平行3份,分别按含量测定项下方法测定盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量,结果见表2。 性定量分析方法,对制剂中黄连的4个成分表小檗碱、黄连碱、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀进行了定性分析,并对盐酸小檗碱、盐酸巴马汀进行了含量测定。

基于原国家食品药品监督管理局《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》规定以检测方中君臣药、贵重药和毒剧药为主的原则,试验初期设计将方中君药姜黄的主要活性成分姜黄素作为含量测定项

质控指标[2],并对其 HPLC含量测定条件进行摸索,结果供试品在与姜黄素对照品色谱峰相应的保留时间无对应峰出现,表明该成分在制剂中含量较低,故未采用姜黄素作为定量指标,而选用含量较高的臣药黄连主要活性成分盐酸小檗碱、盐酸巴马汀作为含量

测定指标[3]。制剂中君药主要有效成分含量较低的原因及对整体药效是否有影响,还需进一步探究。

HPLC测定盐酸小檗碱的流动相体系较多。本试验考察了3 种流动相体系的色谱分离情况[1,4-7]:①乙

腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(每100 mL中加十二烷基硫酸钠 0.4 g,再以磷酸调节pH 值为 4.0);②乙

腈-三乙胺-冰醋酸-水;③乙腈-0.1%磷酸溶液(每

100 mL中加十二烷基磺酸钠0.1 g)。结果供试品溶液以①为流动相,盐酸小檗碱、盐酸巴马汀与其他成分均能很好地分离,供试品色谱图中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀保留时间与对照品一致,且阴性对照无干扰。

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(收稿日期:2017-09-25)

(修回日期:2018-01-02;编辑:陈静)

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