基于 Klotho 研究三七总皂苷对大鼠肾缺血-再灌注损伤的保护机制

庄高建,胡鸿运,杨英,唐紫荆,孙轩龙,刘春燕,唐群

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 -

湖南中医药大学,湖南 长沙 410208

摘要:目的 观察三七总皂苷对肾缺血-再灌注损伤大鼠Klotho蛋白表达的影响,探讨其对模型大鼠的保护机制。方法 实验大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组和三七总皂苷高、中、低剂量组,各给药组给予相应药物,每日 1 次。建立大鼠肾缺血-再灌注损伤模型,造模 4h 后腹主动脉取血处死大鼠。检测大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平及肾组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,HE染色观察肾组织形态变化,免疫组化检测 Klotho、核因子-κB(NF-κB) p65蛋白的表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠血清 BUN、SCr 水平明显升高(P<0.05),肾组织 Klotho蛋白表达降低,NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组 Klotho 蛋白表达升高,NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.05);与阳性药组比较,三七总皂苷高剂量组 Klotho 蛋白表达升高,NF-κB p65 蛋白表达降低(P<0.05)。NF-κB p65 蛋白表达与 Klotho 呈负相关(r=-0.895,P<0.05)。结论 三七总皂苷可能通过上调 Klotho 蛋白表达,减少 NF-κB p65蛋白表达,抑制氧化应激和对抗炎症,从而发挥保护肾脏作用。关键词:肾缺血-再灌注损伤;氧化应激;Klotho;三七总皂苷;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.008

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)11-0031-05

Study on Protective Mechanism of Panax Notoginseng Saponins on Rats with Renal Ischemia Reperfusion Injury Based on Klotho

ZHUANG Gao-jian, HU Hong-yun, YANG Ying, TANG Zi-jing, SUN Xuan-long, LIU Chun-yan, TANG Qun

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Abstract: Objective To investigate the effects of Panax Notoginseng saponins (PNS) on protein expression of Klotho in rats with renal ischemia reperfusion injury; To discuss its protective mechanism for model rats.

Methods Experimental rats were randomly divided into sham-operation group, model group, positive medicine group, PNS high-, medium- and low-dosage groups. Each administration group was given relevant medicine for gavage, once a day. Renal ischemia reperfusion injury model was established. Rats were sacrificed by taking blood from abdominal aorta after 4 hours of modeling. Serum levels of blood urea nitrogen (BUN), creatinine (SCr), malondialdehyde (MDA) content in kidney tissue, superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity were measured. HE staining was used to observe the morphological changes of renal tissue. The protein expressions of Klotho and NF-κB p65 were measured by immunohistochemical method. Results Compared with the sham-operation group, the levels of BUN and SCr in the model group increased significantly (P<0.05); protein expression of Klotho in renal tissue decreased and the protein expression of NF-κB p65 increased (P<0.05). Compared with the model group, the expression of Klotho increased but protein expression of NF-κB p65 decreased in each administration group (P<0.05); Compared with the positive medicine group, the expression of Klotho in PNS

high-dosage group increased but protein expression of NF-κB p65 decreased (P<0.05). The protein expression of NF-κB p65 was negatively related to protein expression of Klotho (r=-0.895, P<0.05). Conclusion PNS can inhibit oxidative stress and anti-inflammatory effects through upregulating protein expression of Klotho, and reduce the protein expression of NF-κB p65, and thus exerts renal protective effects.

Keywords: renal ischemia reperfusion injury; oxidative stress; Klotho; Panax Notoginseng saponins; rats 肾脏血液灌注量较高,对缺血和缺血再灌注敏感性较强。造成缺血性急性肾功能衰竭(ischemic acute renal failure,IARF)的关键环节是肾缺血-再灌注损伤,同时也是肾移植手术中影响肾功能恢复的重要原因。缺血-再灌注损伤和机体内氧化应激及活性氧氧化损伤关系密切[1]。三七总皂苷是三七的主要成分之一,有化瘀止血、抗氧化等药理作用,对缺血性疾病有较好的疗效[2]。本实验复制肾缺血-再灌注损伤大鼠模型,探讨三七总皂苷对模型大鼠的保护机制。

1 材料与方法 1.1 动物

SD雄性大鼠 30 只,SPF 级,体质量 200~220 g,

动物许可证 SCXK(湘)2016-0002,湖南斯莱克景达

实验动物有限公司。饲养于温度 22~25 ℃、相对湿度 50%~60%环境,12 h/12 h昼夜明暗交替,自由摄食饮水。

1.2 药物

三七总皂苷,广西梧州制药(集团)股份有限公

司,批号 17070115;缬沙坦胶囊,北京诺华制药有限

公司,批号X2107,用生理盐水按大鼠体质量配制成

所需剂量的药液。

1.3 主要试剂与仪器

尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶( SOD )、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒,南京建成生物工程研究所;Klotho

蛋白、核因子-κB(NF-κB)p65 抗体试剂盒,北京博奥森生物技术有限公司;浓缩型 DAB 试剂盒,北京中杉金桥生物有限公司。数码医学图像分析系统

(Motic6.0),轮转石蜡切片机(德国徕卡 RM2235),生物组织摊片机(金迪 YD-A ),冰箱(青岛海尔

BCD-226SKA),DNP-9162 电热恒温培养箱(上海一

恒),研究型显微镜(MoticBA410),752 型紫外线可见分光光度计(上海恒平)。

1.4 分组及给药

实验大鼠适应性喂养1周后,称重,按体质量编号,再按随机数表法分为假手术组、模型组、阳性药组和三七总皂苷低、中、高剂量组(中药低、中、高剂量组),每组5只。阳性药组给予55 mg/kg 缬沙坦 灌胃,中药低、中、高剂量组给予 40、80、160 mg/kg三七总皂苷灌胃,给药前用生理盐水配成混悬液,假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积为 10 mL/kg,每日 1次,连续5 d。

1.5 造模

实验大鼠腹腔麻醉,行正中剖腹手术,切除其右侧肾脏组织,游离左侧肾蒂,使用无创性动脉夹,夹闭大鼠左侧肾动脉,造成缺血,45 min 后去掉无创动脉夹恢复肾脏组织血流供应,建立大鼠肾缺血-再灌注损伤模型[3]。供血时观察肾脏颜色,若5 min 后未见肾脏恢复正常鲜红色,则表示造模不成功,30只大鼠均成模。假手术组大鼠只切除右肾,不夹闭左侧肾蒂。造模后4 h腹主动脉取血处死大鼠。

1.6 标本采集及处理

大鼠腹主动脉取血后,3000 r/min 离心 10 min 分离血清,分装后置于-20 ℃冰箱密封保存,用于BUN、SCr检测。分离肾脏周围结缔组织,摘取左侧肾脏,于中上 1/3 横行剖开。上 1/3 肾脏10%多聚甲醛固定,脱水,透明,石蜡包埋,切片,HE 染色,镜下观察

肾组织形态,免疫组化检测 Klotho 蛋白和 NF-κB p65

的蛋白表达;下 2/3 肾组织置于-80 ℃冰箱保存,用于 MDA、SOD、GSH-Px 检测。

1.7 肾功能及氧化应激指标检测

二乙酰肟显色法测定 BUN,碱性苦味酸比色法测定 SCr,TBA 法测定MDA,羟胺法测定SOD,试剂盒检测 GSH-Px。严格按试剂盒说明书进行操作。

752 型紫外线可见分光光度计测定吸光度,计算BUN、SCr、MDA 含量及 SOD、GSH-Px 活性。

1.8 病理观察

取多聚甲醛固定好的肾组织,常规脱水,组织透

明、浸蜡,包埋,切片(4 μm厚)。切片脱蜡,梯度

乙醇脱水,苏木素染色,1%盐酸乙醇分化1~10 s,

0.5%伊红乙醇溶液中染色2~5 min,再梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。镜下观察肾脏组织形态。

1.9 免疫组化检测

采用二步法:脱蜡和水化组织切片;新鲜二甲苯

浸泡 10 min×3,无水乙醇浸泡 3 min×3,95%乙醇

浸泡 3 min×3,75%乙醇浸泡 3 min×2,蒸馏水冲洗

Newspapers in Chinese (Simplified)

Newspapers from China

© PressReader. All rights reserved.