健脾清肠方联合骨化三醇对溃疡性结肠炎大鼠白细胞介素-17 和干扰素-γ表达的影响

CJI (Traditional Chinese Medicine) - - 中国中医药信息杂志 - 基金项目:上海中医药大学预算内项目(1291)通讯作者:林江,E-mail:[email protected]

卢璐,袁建业,费晓燕,卞慧,林江上海中医药大学附属龙华医院,上海中医药大学脾胃病研究所,上海 200032

摘要:目的 观察健脾清肠方联合骨化三醇对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜白细胞介素-17(IL-17)和干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响,探讨其作用机制。方法 实验大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、骨化三醇组、健脾清肠方+骨化三醇组,每组10只。除正常组外,其余各组大鼠予三硝基苯磺酸灌肠造模。造模后第3日大鼠开始给药,开始给药后第11日称重后处死。期间计算疾病活动指数(DAI),光镜下按结肠组织病理学评分(HPS)评估大鼠结肠黏膜损伤程度。采用RT-PCR和免疫组化方法检测结肠黏膜IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表达。结果 模型组 DAI 及 HPS 明显高于正常组(P<0.01);与模型组比较,各给药组 DAI 及 HPS

显著降低(P<0.05,P<0.01),美沙拉嗪组和健脾清肠方+骨化三醇组大鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-17 mRNA 和

蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论 健脾清肠方联合骨化三醇可能通过调节大鼠辅助T淋巴细胞17 细胞,下调 IL-17表达,降低免疫细胞活性,减少炎性细胞分泌,减轻结肠黏膜的损伤。

关键词:健脾清肠方;骨化三醇;溃疡性结肠炎;干扰素-γ;白细胞介素-17;大鼠

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.009

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)11-0036-05

Effects of Jianpi Qingchang Decoction Combined with Calcitriol on IL-17 and IFN-γ in Ulcerative Colitis Rats

LU Lu, YUAN Jian-ye, FEI Xiao-yan, BIAN Hui, LIN Jiang

Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Spleen and Stomach Disease

Research Institute of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China Abstract: Objective To investigate the effects of Jianpi Qingchang Decoction combined with Calcitriol on the expressions of IL-17 and IFN-γ in colitis in rats with ulcerative colitis; To discuss the mechanism of action. Methods Experimental rats were randomly divided into control group, model group, Mesalazine group, Calcitriol group, Jianpi Qingchang Decoction + Calcitriol group, with 10 rats in each group. Except for the control group, other groups were given TNBs for modeling. The administration began on the 3rd day after modeling. All rats were weighed and sacrificed on the 11th day after administration. The disease activity index (DAI) were calculated and the colon histopathological (HPS) were evaluated under microscope. The mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17 in colonic mucosa were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the control group, the DAI and HPS of the model group increased significantly (P<0.01); Compared with the model group, the DAI and HPS of administration groups were reduced significantly (P<0.05, P<0.01), and the mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17 in Mesalazine group and Jianpi Qingchang Decoction + Calcitriol group decreased significantly (P<0.01). Conclusion Jianpi Qingchang Decoction combined with Calcitriol can down-regulate IL-17 expression, decrease the activity of immune cells, reduce the secretion of inflammatory cells, and lessen the damage of colonic mucosa by regulating Th17 cells.

Keywords: Jianpi Qingchang Decoction; Calcitriol; ulcerative colitis; IFN-γ; IL-17; rats

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是指局限于结肠黏膜层的非特异性溃疡性病变。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液血便、发热、贫血等,可并发中

毒性肠扩张、肠出血、肠穿孔。研究显示,UC 患者

普遍存在维生素D 缺乏[1-2]。体外实验表明,VitD 缺

乏的 CD4+T 细胞过量产生白细胞介素-17(IL-17)和干扰素-γ(IFN-γ),而活性 VitD3 可抑制辅助T 淋巴细胞 17(Th17)细胞,从而改善 Th17 细胞所介导的炎症反应[3]。本课题组针对 UC 脾气亏虚、湿毒蕴结的病机关键,自拟健脾清肠方用于临床,疗效较好。本实验观察健脾清肠方联合骨化三醇对三硝基苯磺酸(TNBs)诱导 UC 大鼠 IL-17、IFN-γ 的影响,从细胞层面探讨中药及维生素 D 对 UC 的免疫调节机制。

1 实验材料

1.1 动物

清洁级雄性SD 大鼠 50 只,体质量(200±20)g,上海中医药大学实验动物中心。饲养于昼夜光线变化、恒湿、恒温环境,自由摄食饮水,实验前适应性饲养 1 周。

1.2 药物健脾清肠方颗粒(党参15 g,黄芪 30 g,黄连 6 g,

马齿苋 30 g,地榆 15 g,白及 3 g,三七 6 g,木香 9 g,

甘草 6 g),上海中医药大学附属龙华医院中药房提

供。美沙拉嗪肠溶片,0.25 g/粒,葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司,批号111206;骨化三醇胶丸, 0.25 μg/粒,瑞士上海罗氏制药有限公司,批号

H20150127。1.3 主要试剂与仪器戊巴比妥(上海西唐生物),TNBs 原液(德国Sigma),兔抗 IFN-γ、兔抗 IL-17 及即用型 SABC 免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物),FQ-PCR试剂盒(上海达为科生物)。显微镜(日本OLYMPUS), PCR仪(加拿大 Funglyn Biotech),Powerlab 数据分析系统(澳大利亚 ADInstruments)。2 实验方法2.1 分组及造模50只大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、骨化三醇组和健脾清肠方+骨化三醇组,每组10 只。除正常组外,其余4组大鼠均予戊巴比妥钠麻醉后予TNBs 灌肠法造模[4]。造模后每日观察并记录大鼠大便数量、性状及体质量、精神活动等。

2.2 给药

大鼠造模后第3日,除模型组外,其余各组大鼠给予 1.0 mL/200 g体质量灌胃,每日1次,连续 10 d。正常组予蒸馏水灌胃;骨化三醇组用无菌大豆油将骨化三醇胶丸中液体稀释,配制成浓度为1 μg/mL 混悬 液灌胃[5-6];健脾清肠方+骨化三醇组将健脾清肠颗粒剂加蒸馏水配制成196.9 mg/mL 溶液与1 μg/mL 骨化三醇混悬液充分混合后灌胃;美沙拉嗪组将美沙拉嗪肠溶片研磨成细粉,加入蒸馏水配制成112 mg/mL混悬液灌胃。药物用量按照人和动物间体表面积折算等效剂量比值表[7]计算。2.3 标本采集

各组大鼠给药后第 11 日称重并处死,迅速剖取自肛门往上至 8 cm的结肠,生理盐水冲洗干净,将结肠黏膜层向上置于白色卡纸上,肉眼观察结肠黏膜急性损伤程度。随后挑取黏膜破损最为显著处病变肠段,沿纵轴切开,分为2部分,一部分于10%甲醛中固定,剩余标本装入 Eppendorf 管后,-80 ℃冰箱保存,分别行病理、免疫组化及RT-PCR 检测。2.4 大鼠疾病活动指数及结肠组织病理学评分造模后每日大鼠称重,观察大鼠活动及大便数量和性状,计算疾病活动指数(disease activity index, DAI)[8]。常规 HE 染色后,光镜下按结肠组织病理学评分(histopathological score,HPS)评估 UC大鼠结肠黏膜损伤程度[9]。2.5 免疫组化检测结肠黏膜白细胞介素-17和干扰素-γ蛋白表达结肠组织经切片、烤片、脱蜡、水化及热抗原修复后,滴加 IFN-γ、IL-17 一抗(工作浓度均为1∶100), 4 ℃过夜,PBS洗2 min×3次。滴加二抗37 ℃ 20 min;

PBS洗2 min×4次。滴加3抗后置恒温箱37 ℃ 20 min。

PBS 洗 5 min×4 次,标本置于PBS。加入 DAB 显色液(先抽吸 1 mL 蒸馏水,再加入 DAB 显色液各 1滴),加 20 —L至标本上完全覆盖,显色5 min 后,用蒸馏水冲洗,复染后乙醇由低至高浓度逐级脱水,加入二甲苯后封片,镜检。每张切片随机选定3个视野

(×200),运用医学图像定量分析系统对免疫组化图像中阳性区域面积及光密度(OD)值进行测定,计算免疫组化指数(IHC)。IHC=阳性面积×OD 值÷总面积。2.6 RT-PCR 检测结肠黏膜白细胞介素-17 和干扰素-γ基因表达

取结肠组织提取总RNA,移至5 mL玻璃试管中,

每一试管加入1 mL预冷 Trizol,匀浆。每个标本处理后棉球擦拭,DEPC处理水清洗;依次将匀浆液转至1.5 mL Eppendorf 管。各管中加 200 μL氯仿,振荡摇匀 15 s;4℃、12 000 r/min 离心 15 min;吸出水层加至 Eppendorf 管,再加二倍体积异丙醇(约600 μL),

混匀,置于-20 ℃冰箱 30 min;4 ℃、10 000 r/min 离

心 15 min。弃上清液留沉淀;用 650 μL 75%乙醇洗涤

沉淀,4 ℃、8000 r/min 离心 5 min,弃上清液留沉淀;

打开管盖,65 ℃干式恒温器烘干5~10 min。20 μL DEPC处理水,溶解 RNA,-20 ℃冰箱保存待用。反转录制备 cDNA,将制备好 cDNA 进行 PCR 扩增,

并运用 Prism7500 软件(上海生工)设计并合成引物,最后采用相对定量,比较管家基因(GAPDH)与目的基因的 Ct值,得出所测标本目的基因相对表达量。相对 mRNA 表达=2-ΔCt×100%,ΔCt 值=Ct 值靶基因- Ct 值 GAPDH。

3 统计学方法

采用 Graphpad Prism5.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s — 表示,组间比较用 Student's t检验,多组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。4 结果

4.1 一般状况

造模后第1日大鼠大便次数逐渐增多,粪质稀软;造模后第3日症状达到高峰,90%大鼠出现黏液脓血便,并且嗜卧扎堆、毛色无华;给药第 10 日模型组大鼠仍有黏液血便而健脾清肠方+骨化三醇组大鼠粪便尚不成形,但黏液脓血基本消失;美沙拉嗪组大鼠无黏液脓血便且大便多数成形,偶见软便。4.2 疾病活动指数和病理学评分比较与正常组比较,模型组大鼠 DAI 及 HPS 明显升高(P<0.01);与模型组比较,美沙拉嗪组和健脾清肠方+骨化三醇组大鼠 DAI 及 HPS 明显降低(P< 0.05,P<0.01),二者比较差异无统计学意义(P>

5 讨论

一般认为,UC 的发病与患者免疫功能紊乱密切相关,目前治疗以水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂为主,但不良反应大,而生物制剂又因其价格昂贵,只能使极少部分患者获益。

研究表明,维生素D除能调节体内钙磷代谢、维护骨骼生长发育的功能外,活性维生素D可通过直接或间接的方式诱导抑制UC发展的调节T细胞而发挥

免疫调节作用[10]。Hu Y 等[11]发现 25(OH)D3 可通过抑制 Th17 细胞发育,使 IL-6 表达上调,起到抑制

Th17细胞的免疫应答反应。此外,在敲除IL-10 的小鼠实验中发现,维生素D缺乏可加重炎症性肠病的症状和病死率,而给予足量25(OH)D3 能有效缓解症状,说明维生素D缺乏与本病的发生具有相关性[12]。本课题组曾收集了2016年住院治疗的UC患者共108例,并对患者血清25(OH)D3 水平与UC活动度进行相关性分析后发现,UC患者确实存在维生素D缺乏及骨量减少/骨质疏松,且维生素 D 缺乏与 UC 的严重程度呈正相关[13]。因此,补充维生素 D 可能是治疗UC的有效手段。Th 细胞有许多亚群,而 Th1 和 Th2 细胞比例失调在UC发病机制中具有重要作用。CD4+T细胞可分为 Th1 和 Th2 细胞,IL-12 能诱导幼稚的 CD4+T 细胞分化为 Th1细胞,并通过分泌 IL-2、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、IFN-γ 等多种细胞因子调节细胞免疫;而Th2 细胞则以 IL-4驱动的细胞因子调节体液免疫。直

至 2005 年,Harrington L E 等[14]发现了独立于 Th1、

Th2细胞外分化途径和功能的CD4+T 细胞,因其能特异性产生 IL-17,故将其命名为 Th17 细胞。Th17 细胞是自身免疫病发生发展的关键因素,它主要分泌

IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-21、IL-22 及 TNF-α。作为 Th17 分泌的主要效应因子,IL-17A主要通过聚集并激活中性粒细胞,诱导活化多种细胞产生炎性介质,最终导致各类炎性反应的发生。

病。Raza已有诸多研究表明,Th17 A 等[15]认为 IL-17A 产生外周血单个核细胞细胞参与了 UC 的发的数量与IL-17 UC在炎症性肠病患者肠道中的致病作用。患者的疾病严重程度相关,这个结果暗示了

Iwakura Y 等[16]也证实 IL-17 能通过诱导粒细胞的募TNF-α、IL-6集和活化,从而促进其他炎性因子如 等

产生。目前,国内也有多项相关研究发现,IL-17 主要位于黏膜上皮、固有层、黏膜下层中浸润的炎性细胞中,TNBs 造模后结肠黏膜 IL-17 的表达升高,而

经氨基水杨酸或姜黄素治疗后IL-17 的表达下降[17]。本课题组在马贵同和谢建群教授的带领下多年致力于UC的中医药研究,认为UC的病机以脾胃虚弱为本,湿热内生为标,并贯穿于疾病的始终。湿热蕴与气血相搏以致肠道传导失司,肠内糟粕与湿热浊邪蕴结,血脉受损,化腐成脓,日久正虚邪恋,病程缠绵,反复发作,所以治疗上宜标本兼顾,在清热化湿、活血通络的同时,将补益脾肾之气贯穿始终。本课题组自拟健脾清肠方,该方重用健脾益气之党参、黄芪以补脾胃之虚,辅以黄连、马齿苋、地榆、三七、白及以清热解毒、活血化瘀,使湿热浊气尽除,血脉之气通顺,而显效于临床。维生素D缺乏的UC患者常表现为多汗、夜惊、疲乏无力及骨质疏松症,符合中医脾气亏虚的范畴,故而从健脾益气角度入手治疗UC与补充维生素D相联合的方法,或可能提高治疗的效果。基于上述背景,本研究在TNBs诱导的大鼠实验性 UC模型中,根据DAI、病理组织学评分和 IFN-γ、IL17 含量测定,比较健脾清肠方及维生素 D 对实验性结肠炎动物模型的治疗效果,同时探索维生素D对T细胞免疫的调节作用机制。结果显示,健脾清肠方联合骨化三醇治疗后大鼠结肠黏膜 IFN-γ 和 IL-17 表达水平较模型组有明显下降趋势,表明健脾清肠方联合维生素 D 可能是通过调节 Th17 细胞下调 IL-17 mRNA水平,降低免疫细胞的活性,减少炎性细胞的分泌,从而使大鼠结肠黏膜的损伤得以减轻。参考文献:

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(收稿日期:2018-04-21)

(修回日期:2018-05-27;编辑:华强) 开放科学(资源服务)标识码(OSID)内含全文PDF和增强文件

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